Izolace genomové DNA pomocí fenol-chloroformu

IZOLACE POMOCÍ FENOL- CHLOROFORMU

Izolace pomocí fenol-chloroformu je klasickým způsobem izolace DNA. Tato izolace je poměrně pracná a zdlouhavá, ale poskytuje velké množství velmi čisté DNA.

K lyzátu, který se ponejprv získá rozrušením tkání a buněk, a působením proteázy, se postupně přidává fenol či směs fenolu a chloroformu, které z lyzátu vyváží proteiny. Přidáním těchto látek k vodnému roztoku dojte k separaci roztoku do dvou fází. Horní fáze je vodný roztok obsahující DNA, spodní je pak organická fáze fenolu či chloroformu. Mezi vodnou a organickou fází se hromadí proteiny.

Princip této metody tkví v tom, že DNA se díky své polaritě ochotně rozpouští v polárním vodném roztoku. Naproti tomu je fenol v porovnání s vodou daleko mnohem méně polární, a proto se v něm DNA rozpouští mnohem hůře. Co se týče ale proteinů, jejich polarita je dána jednotlivými aminokyselinami, a proto část řetězce je více polární a část méně polární. Část řetězce daného proteinu by se ráda rozpustila ve vodě a část ve fenolu. Z toho důvodu se proteiny hromadí na rozhraní mezi vodným roztokem a organickou fází. Opakovaným přidáváním fenol/chloroformu a postupným odebíráním a přečišťováním vrchní fáze, dochází k postupnému pročišťování roztoku DNA od proteinů.

——————————————————————————————————————————-

ZÁKLADNÍ POSTUP PŘI IZOLACI DNA FENOL-CHLOROFORMEM

• Mechanické rozrušení tkání/pletiv

• Rozrušení celistvosti buněk a natrávení proteinů pomocí lyzačního roztoku (komponenty lyzačního roztoku viz. Izolace genomové DNA)

• Opakované pročišťování roztoku od proteinů pomocí fenol-chloroformu v kombinaci s

centrifugací

• Precipitace DNA pomocí přídavku etanolu a octanu sodného a extrakce DNA z roztoku (viz. Precipitace DNA)

• Příprava výsledného roztoku DNA rozpuštěním DNA ve vodě či pufru

• Kontrola integrity DNA elektroforetickou separací

• Stanovení koncentrace DNA v získaném roztoku