Řešení problémů s PCR

Produkt v negativní kontrole:

  • Způsobeno kontaminací buď při přípravě reakce nebo kontaminací přímo v některé chemikálii.

 

Žádný nebo slabý produkt:

  • Snižte teplotu nasedání primerů
  • Zvyšte koncentraci primerů nebo množství templátové DNA nebo Taq polymerázy.
  • Změňte koncentraci KCl. Zvyšte koncentraci, pokud očekávaný produkt je kratší než 1 kb, nebo koncentraci snižte, pokud očekávaný produkt je delší než 1 kb.
  • Přidejte BSA na koncentraci 0,1 – 0,8 µg/µl.
  • Zkontrolujte správnost sekvence primerů.
  • Můžete zkusit kombinaci bodů 1-5.

Dlouhé nespecifické produkty:

  • Snižte čas nasedání primerů.
  • Zvyšte teplotu nasedání primerů.
  • Snižte čas extense.
  • Snižte teplotu extense na 62 – 68 0C.
  • Zvyšte koncentraci KCl 1,2x – 2x, ale zachovejte koncentraci MgCl2 na 1,5 – 2 mM.
  • Zvyšte koncentraci MgCl2 na 3 – 4,5 mM ale zachovejte koncentraci dNTP stejnou.
  • Použijte méně primerů nebo templátu nebo Taq polymerázy.
  • Kombinujte body 1-7.

Krátké nespecifické produkty:

  • Zvyšte čas nasedání primerů.
  • Zvyšte teplotu nasedání primerů.
  • Zvyšte čas extense.
  • Zvyšte teplotu extense na 62 – 68 0C.
  • Snižte koncentraci KCl 0,7 – 0,8x, ale zachovejte koncentraci MgCl2 na 1,5 – 2 mM.
  • Zvyšte koncentraci MgCl2 na 3 – 4,5 mM ale zachovejte koncentraci dNTP stejnou.
  • Použijte méně primerů nebo templátu nebo Taq polymerázy.
  • Kombinujte body 1-7.