Jaké jsou nejčastější problémy s PCR a jak je řešit?
Produkt v negativní kontrole:
• Způsobeno kontaminací buď při přípravě reakce nebo kontaminací přímo v některé chemikálii.
Žádný nebo slabý produkt:
• Snižte teplotu nasedání primerů
• Zvyšte koncentraci primerů nebo množství templátové DNA nebo Taq polymerázy.
• Změňte koncentraci KCl. Zvyšte koncentraci, pokud očekávaný produkt je kratší než 1 kb, nebo koncentraci snižte, pokud očekávaný produkt je delší než 1 kb.
• Přidejte BSA na koncentraci 0,1 – 0,8 µg/µl.
• Zkontrolujte správnost sekvence primerů.
• Můžete zkusit kombinaci bodů 1-5.
Dlouhé nespecifické produkty:
• Snižte čas nasedání primerů.
• Zvyšte teplotu nasedání primerů.
• Snižte čas extense.
• Snižte teplotu extense na 62 – 68 0C.
• Zvyšte koncentraci KCl 1,2x – 2x, ale zachovejte koncentraci MgCl2 na 1,5 – 2 mM.
• Zvyšte koncentraci MgCl2 na 3 – 4,5 mM ale zachovejte koncentraci dNTP stejnou.
• Použijte méně primerů nebo templátu nebo Taq polymerázy.
• Kombinujte všechny uvedené body.
Krátké nespecifické produkty:
• Zvyšte čas nasedání primerů.
• Zvyšte teplotu nasedání primerů.
• Zvyšte čas extense.
• Zvyšte teplotu extense na 62 – 68 0C.
• Snižte koncentraci KCl 0,7 – 0,8x, ale zachovejte koncentraci MgCl2 na 1,5 – 2 mM.
• Zvyšte koncentraci MgCl2 na 3 – 4,5 mM, ale zachovejte koncentraci dNTP stejnou.
• Použijte méně primerů nebo templátu nebo Taq polymerázy.
• Kombinujte body 1-7. Pro zvýšení specificity reakce můžete použít některou z modifikací PCR, jako je Hot-start PCR, nested PCR nebo Touch-down PCR.