Izolace pomocí fenol-chloroformu je klasickým způsobem izolace DNA. Tato izolace je poměrně pracná a zdlouhavá, ale poskytuje velké množství velmi čisté DNA.
K lyzátu, který se ponejprv získá rozrušením tkání a buněk a působením proteázy, se postupně přidává fenol či směs fenolu a chloroformu, které z lyzátu vyváží proteiny. Přidáním těchto látek k vodnému roztoku dojte k separaci roztoku do dvou fází. Horní fáze je vodný roztok obsahující DNA, spodní je pak organická fáze fenolu či chloroformu. Mezi vodnou a organickou fází se hromadí proteiny.
Princip této metody tkví v tom, že DNA se díky své polaritě ochotně rozpouští v polárním vodném roztoku. Naproti tomu je fenol v porovnání s vodou daleko mnohem méně polární, a proto se v něm DNA rozpouští mnohem hůře. Co se týče ale proteinů, jejich polarita je dána jednotlivými aminokyselinami, a proto část jejich řetězce je více polární a část méně polární. Část řetězce daného proteinu má tendenci se rozpustit ve vodě a část ve fenolu. Z toho důvodu se proteiny hromadí na rozhraní mezi vodným roztokem a organickou fází. Opakovaným přidáváním fenol-chloroformu k roztoku DNA a odebíráním vrchní fáze dochází k postupnému pročišťování roztoku od proteinů.
————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————-
ZÁKLADNÍ POSTUP PŘI IZOLACI DNA FENOL-CHLOROFORMEM
- Mechanické rozrušení tkání/pletiv.
- Rozrušení celistvosti buněk a natrávení proteinů pomocí lyzačního roztoku.
- Opakované pročišťování roztoku od proteinů pomocí fenol-chloroformu v kombinaci s centrifugací.
- Precipitace DNA pomocí přídavku etanolu a octanu sodného a extrakce DNA z roztoku.
- Příprava výsledného roztoku DNA rozpuštěním DNA ve vodě či pufru.
- Kontrola integrity DNA elektroforetickou separací.
- Stanovení koncentrace DNA v získaném roztoku.
————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————-