Proces izolace či extrakce DNA je získávání DNA z daného vzorku za použití kombinace chemického a fyzikálního přístupu.
Při izolaci genomové DNA postupujeme v těchto krocích:
1. Rozrušení tkáně za použití tloučků, homogenizátorů či sonikátoru
2. Rozrušení celistvosti buněk buněčnou lyzí pomocí lyzačních roztoků a natrávení proteinů pomocí přidané proteázy
Komponenty lyzačního roztoku:
• U baktérií a rostlinných buněk je důležité nejprve rozrušit buněčnou stěnu. Toho docílíme tím, že do lyzačního roztoku přidáme lysozym nebo CTAB nebo celulázu. U živočišných buněk stačí destabilizovat buněčnou membránu slabými neiontovými detergenty (např. 0,5% SDS), které způsobí snížení osmolarity a popraskání buněk.
• V lyzačním roztoku je rovněž přítomná proteáza (nejčastěji Proteináza K), která natráví přítomné proteiny, a RNáza pro odstranění RNA.
• Přítomná je EDTA, tzv. chelatační činidlo, která vyvazuje dvojmocné kationty, ty jsou důležité pro aktivitu enzymů deoxyribonukleáz (DNáz). Pokud by nedošlo v roztoku k vyvázání dvojmocných iontů, došlo by vlivem působení DNáz k degradaci DNA.
3. Separace DNA od proteinů a dalších příměsí
4. Získání roztoku DNA
5. Kontrola celistvosti DNA elektroforetickou separací
6. Stanovení koncentrace DNA v roztoku
ZPŮSOBY JAK IZOLOVAT GENOMOVOU DNA
• pomocí fenol-chloroformu
• pomocí gravitačních kolonek
• pomocí chelexu (v případě DNA)
• pomocí komerčních produktů založených na bezkolonkovém přístupu