Nukleázy

Nukleázy jsou enzymy štěpící nukleové kyseliny rozkladem fosfodiesterové vazby. Nukleázy rozlišujeme na endonukleázy a exonukleázy.

Endonukleázy štěpí fosfodiesterové vazby uvnitř řetězce nukleové kyseliny. Naproti tomu exonukleázy štěpí nukleovou kyselinu od jejich konců, a to tak, že štěpením fosfodiesterové vazby postupně odštěpují jednotlivé nukleotidy. Dále rozlišujeme deoxyribonukleázy, které štěpí DNA, a ribonukleázy, které štěpí RNA.

 

 

Kohesivní versus tupé konce

Při štěpení některými exonukleázami je rozhodující tvar konců. Tj. některé exonukleázy vyžadují pro svou aktivitu tupé konce či naopak konce s přesahy, tzv. kohesivní. Kohesivní versus tupé konce jsou také produktem štěpení příslušnými endonukleázami.

———————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————

DNáza I

Jedná se o endonukleázu, která štěpí jedno- a dvouřetězcovou DNA. Hydrolyzuje fosfodiesterové vazby, čímž vytváří mono- a oligodeoxyribonukleotidy s 5′-fosfátovou skupinou a 3′-OH skupinou. Aktivita enzymu je striktně závislá na přítomnosti Ca²⁺ a je aktivovaná ionty Mg²⁺ nebo Mn²⁺. V přítomnosti Mg²⁺, DNása I štěpí každý z řetězců dvouřetězcové molekuly DNA nezávisle. V přítomnosti Mn²⁺, DNása I štěpí oba řetězce dvouřetězcové molekuly DNA přibližně ve stejném místě, čímž vytváří fragmenty s tupými konci či převisy jednoho či dvou nukleotidů.

DNáza je vysoce citlivá na mechanické poškození. S roztokem DNázy zacházejte opatrně, nevortexujte, opatrně pipetujte. Promíchávejte opatrným otáčením zkumavky.

 

Nejčastější využití

• Odstranění DNA ze vzorku RNA

• Odstranění templátové DNA při in vitro transkripci

• Značení DNA nick-translací ve spojení s DNA polymerázou I

• Tvorba DNA knihoven produkcí náhodně překrývajících se fragmentů DNA (s využitím pufru obsahujícího Mn²⁺)

 

———————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————

dsDNáza

Tento enzym štěpí fosfodiesterové vazby v DNA a produkuje oligonukleotidy s 5′-fosfátovou skupinou a 3′-hydroxylovou skupinou na jejich koncích. Je vysoce specifický k dvouřetězcové DNA, čímž je zajištěno, že RNA a jednořetězcová DNA přítomné ve vzorku nejsou štěpeny. Tato DNáza je velmi snadno ve vzorku inaktivována, a to zahřátím na 55°C.

 

Nejčastější využití

• Odstraňování genomové DNA ze vzorku RNA

———————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————

Endonukleáza IV (Endo IV)

Tato endonukleáza rozpoznává na DNA abazická místa a v těchto místech štěpí fosfodiesterovou vazbu. Enzym může v těchto místech rovněž fungovat jako 3′-diesteráza, takže je schopen produkovat 3’ fosfoglykolát a 3’ fosfát. Endo IV má také 3′->5′ exonukleázovou aktivitu.

 

Nejčastější využití

• Analýza poškození DNA a aktivity opravných mechanismů

• Comet assay

———————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————

Endonukleáza V (EndoV)

Endonukleáza V je opravný enzym, který rozpoznává deoxyinosin, což je produkt deaminace deoxyadenosinu v DNA, a v menší míře také abazická místa, chybně spárované báze, vlásenky a smyčky.

 

Nejčastější využití

• Při studiu mutageneze a DNA reparačních mechanismů

———————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————

Exonukleáza I (ExoI)

Exonukleáza I rozkládá jednořetězcovou DNA, a to ve směru 3′->5′. Produkuje deoxyribonukleosid 5’-monofosfáty a na 5’konci zanechává dinukleotidy.

 

Nejčastější využití

• Odstranění primerů po PCR reakci

• Enzym není vhodný pro odstraňování 3’ převisů u dvouřetězcové DNA

———————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————

Exonukleáza III (ExoIII)

Exonukleáza III degraduje dvouřetězcovou DNA s tupých konců, 5’ převisů nebo jednořetězcových štěpů, přičemž uvolňuje 5′-mononukleotidy z 3′ konců DNA a produkuje úseky jednořetězcové DNA. Není aktivní na 3’ převisech, které jsou alespoň čtyři báze dlouhé.Enzym rovněž vykazuje aktivitu RNázy H, 3´-fosfatázy and AP-endonukleázy.

 

Nejčastější využití

• Produkce jednořetězcových fragmentů DNA

———————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————

Lambda (λ) exonukleáza

Lambda Exonukleáza je aktivní na dvouřetězcové DNA ve směru 5′->3′, kdy odštěpuje 5’ mononukleotidy. Selektivně štěpí 5’ fosforylovaný konec dvouřetězcové molekuly DNA. Enzym rovněž vykazuje nízkou aktivitu na jednořetězcové DNA a na nefosforylované DNA. Je neaktivní na jednořetězcových štěpech nebo mezerách.

 

Nejčastější využití

• Produkce jednořetězcové DNA, např. jednořetězcové DNA z PCR produktů

———————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————

Mikrokokální nukleáza (S7 nukleáza)

Je relativně nespecifická endo-exonukleáza, která štěpí jedno- a dvouřetězcovou DNA a RNA, nicméně více je aktivní na jednořetězcových substrátech, rovněž štěpí preferenčně na AT či AU bohatých oblastech. Aktivita enzymu je striktně závislá na přítomnosti Ca²⁺.

 

Nejčastější využití

• Sekvenování RNA

• Analýza struktury chromatinu

———————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————

RNáza A

RNáza A je endoribonukleáza, která specificky štěpí jednořetězcovou RNA na cytosinu a uracilu. Štěpí fosfodiesterovou vazbu mezi 5’-ribosou nukleotidu a fosfátovou skupinou umístěnou na 3’ ribose sousedního pyrimidinu. Výsledkem je 2’,3’ cyklický fosfát, který je hydrolyzován na příslušný 3’ nukleosid fosfát. Enzym je aktivní při širokém rozsahu podmínek. Při nízkých koncentracích solí (0 až 100 mM NaCl), štěpí jedno- a dvouřetězcovou RNA a stejně tak RNA v RNA-DNA hybridech. Při vysokých koncentracích NaCl (> 0,3 M) RNáza A specificky štěpí jednořetězcovou RNA.

 

Nejčastější využití

• Odstraňování RNA při izolaci genomové a plasmidové DNA a přípravě rekombinantních proteinů

• Ribonuclease protection assay

———————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————

RNáza H

RNáza H specificky štěpí RNA v RNA-DNA hybridech. Neštěpí jednořetězcovou a dvouřetězcovu DNA nebo RNA.

 

Nejčastější využití

• Odstranění RNA z molekuly RNA/DNA po syntéze prvního vlákna cDNA

———————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————

RNáza I

Je endoribonukleáza, která preferenčně hydrolyzuje jednořetězcovou RNA na nukleosidy 3’ monofosfáty. Může být inaktivovaná inkubací v 100 °C po dobu 30 minut.

 

Nejčastější využití

• Odstranění RNA z roztoků DNA a po přípravě rekombinantních proteinů

• Ribonuclease protection assay

———————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————

S1 nukleáza

Tento enzym štěpí jednořetězcové nukleové kyseliny s produkcí 5′-fosforyl mono- nebo oligonukleotidů. Je 5x aktivnější na DNA než RNA. S1 nukleáza rovněž štěpí dvouřetězcovou DNA v jednořetězcových místech jako jsou jednořetězcové štěpy nebo jednořetězcové mezery, smyčky nebo nespárované báze. Enzym vykazuje 3′-fosfomonoesterázovou aktivitu. Při své vysoké koncentraci a nízké koncentraci solí způsobuje zlomy v dvouřetězcové DNA, RNA a DNA/RNA hybridech.

 Nejčastější využití

• Odstranění jednořetězcových převisů u DNA fragmentů

• S1 transkript mapování

• Tvorba delecí ve fragmentech DNA ve spolupráci s Exonukleázou III