Pojmem purifikace je míněno přečištění roztoku nukleových kyselin od nechtěných příměsí. Jedná se o:

  • přečištění vzorku DNA či RNA od proteinů, které zbyly po předcházející izolaci nukleové kyseliny, tj. předcházející extrakce DNA/RNA nebyla dostatečně účinná a roztok není dostatečně čistý,
  • přečištění DNA/RNA po enzymatické reakci, např. po PCR nebo po restrikčním štěpení,
  • přečištění roztoku DNA/RNA od dalších příměsí jako jsou např. soli.

Purifikace DNA pomocí fenol-chloroformu je zkrácenou verzí postupu izolace DNA fenol-chloroformem. Detailnější informace k oběma metodám najdete v sekci Izolace DNA fenol-chloroformem. Při purifikaci vzorku DNA postupuje následovně.

 

Nejprve se provede extrakce proteinů:

  • Přidáme stejný objem fenolu případně fenol-chloroformu-isoamylalkoholu (25:24:1) jako je objem roztoku. Pokud pracujeme s fragmenty DNA, roztok zvortexujeme. Pokud pracujeme s genomovou DNA a máme zájem o co nejlepší zachování její integrity, roztok necháme zvolna promíchávat v horizontálním směru 15 min při pokojové teplotě. Centrifugujeme 10 min při 6000 g.

 pH použitého fenolu musí být 8. Fenol vhodný pro izolaci DNA lze již přímo koupit nebo si ho lze v laboratoři připravit. 

  • Odebereme horní fázi a dáme ji do čisté zkumavky. Přidáme stejný objem chloroformu-isoamylalkoholu (24:1) a opakujeme předcházející krok.
  • Dle potřeby můžeme předcházející krok opakovat 1 – 2x.

V roztoku, z něhož je DNA následně precipitována, nesmí být zbytky fenolu či chloroformu, které by mohly jednak narušit účinnost následné precipitace, jednak by kontaminovaly výsledný roztok DNA. Aby bylo zajištěno, že v roztoku nezbude žádný fenol či chloroform, je doporučováno roztok ještě jednou centrifugovat, do čisté zkumavky odebrat většinu roztoku opatrným pipetováním a to s tím, že na dně zkumavky je ponechán malý zbytek roztoku.

 

Poté provedeme DNA precipitaci

  • Pro precipitaci přidáme 1/10 objemu 3 M Na-acetátu (pH 5,2) a 2,5x objem 100% etanolu a promícháme. Pokud pracujeme s malým množstvím DNA (< 2 μg), pro snadnější zviditelnění sedimentu v následném centrifugačním kroku přidejte glykogen (0,5 μl glykogenu o koncentraci 50 mg/ml do roztoku DNA o objemu 500 μl) nebo tRNA (o finální koncentraci 50 μg/ml).
  • Roztok centrifugujeme 10 min při 13 000 rpm. Centrifugací se vytvoří pelet DNA na dně zkumavky.
  • Odstraníme horní vrstvu etanolu a přidáme stejný objem 75% etanolu, centrifugujeme (13 000 rpm, 10 min, 4 °C).
  • Důkladně odstraníme etanol, krátce (5 min) necháme vyschnout (kapky etanolu usazené po stěnách můžeme případně krátce centrifugovat a odsát pipetou) a sediment DNA rozpustíme ve vodě nebo TE pufru.

   Intenzitu precipitace můžeme zvýšit jednak tím, že 100% etanol, který použijeme k precipitaci je předchlazen na -20°C nebo také uložením vzorku po přidání etanolu a octanu sodného do -20 °C na více než 1 hodinu.