Roztok nukleových kyselin se spektrofotometricky vyhodnocuje při vlnové délce 260 nm a 280 nm. Absorbance při 260 nm odráží koncentraci nukleové kyseliny, absorbance při 280 nm odráží její čistotu, tj. míru přítomnosti proteinů.
Pro výpočet koncentrace se vychází z následujících vztahů:
Při vlnové délce 260 nm je absorbance roztoku rovna 1, pokud je v měřeném roztoku:
– dvouřetězcová DNA o koncentraci 50 µg/ml
– jednořetězcové DNA o koncentraci 37 µg/ml
– RNA o koncentraci 40 µg/ml
————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————
POSTUP PŘI SPEKTROFOTOMETRICKÉM VYHODNOCENÍ
- Roztok nukleové kyseliny se naředí. Obvykle je to buď 50x nebo 100x nebo 1000x. Protože přesnější měření získáme při vyšší koncentraci roztoku, je míra ředění kompromisem mezi přesností měření a množstvím nukleové kyseliny, které kvůli měření ztratíme. Směrodatným faktorem je rovněž typ a velikost spektrofotometrické kyvety a typ spektrofotometru (tj. především výška probíhajícího paprsku). Roztok nukleové kyseliny tedy naředíme např. 100x, tj. 1:100. Roztok důkladně promícháme.
- Nejprve spektrofotometr vynulujeme oproti slepému vzorku („blank“), kterým je obvykle voda, která byla použita pro ředění roztoku, případně to může být jiný roztok použitý k ředění.
- Změříme absorbanci roztoku DNA či RNA při 260 nm a poté při 280 nm. Výsledná hodnota je např. A260=0,02 a A280=0,009.
- Vypočítáme poměr A260/A280, který nám poskytuje informaci o čistotě roztoku. Čistá DNA obvykle vykazuje hodnotu tohoto poměru okolo 1,8 a u RNA je to okolo 2. Pokud hodnota poměru je výrazně nižší, je roztok kontaminován obvykle proteiny či fenolem (v případě fenol-chloroformové extrakce). V našem případě je A260/A280=2,2.
- Vypočítáme koncentraci nukleové kyseliny dle hodnoty naměřené při A260 a vztahu uvedeného v textu výše a míře naředění roztoku DNA.
V našem případě tedy 50 x 0,02 x 100 = 100 µg/ml = 100ng/µl
Obecně pro ds DNA: 50 x A x ředění = ng/µl
Obecně pro ss DNA: 37 x A x ředění = ng/µl
Obecně pro RNA: 40 x A x ředění = ng/µl
Při měření více vzorků a také po skončení měření dbáme na důkladné vypláchnutí spektrofotometrické kyvety.