DNA polymerázy jsou enzymy, které zajišťují syntézu DNA. Rozlišujeme DNA-dependentní DNA polymerázy, které jako templát využívají DNA, a RNA-dependentní DNA polymerázy (tzv. reverzní transkriptázy), které využívají jako templát RNA.
Činnost DNA polymeráz lze charakterizovat takto:
Při své činnosti přisedají k jednořetězcovému úseku DNA či RNA, podle kterého tvoří nový řetězec, a který takto funguje jako tzv. templát. DNA polymerázy ke své činnosti templát obvykle vyžadují, nicméně jsou výjimky, které provádí syntézu bez templátu, např. se jedná o terminální deoxynukleotidyltransferázu.
DNA polymeráza začíná syntézu od krátkého oligonukleotidu (tzv. primeru), který je díky komplementaritě přisedlý k templátovému řetězci.
DNA polymeráza přidá k 3’ konci tohoto primeru dle templátového řetězce příslušný deoxyribonukleotid (dNTP) a syntéza DNA se rozjíždí postupným přidáváním dalších dNTP. Jednotlivé dNTP jsou pospojovány prostřednictvím fosfodiesterových vazeb, které se vytváří mezi fosfátovou skupinou jednoho deoxyribonukleotidu a 3’ uhlíkem druhého deoxyribonukleotidu.
Díky tomuto mechanismu se syntetizovaný řetězec prodlužuje ve směru 5’→3′.
Exonukleotická aktivita DNA polymeráz
Některé DNA polymerázy mají exonukleolytickou aktivitu, tzn. jsou schopny rozkládat řetězec DNA. Rozlišujeme 3’→5′ exonukleázovou („proofreading“) aktivitu a 5’→3′ exonukleázovou.
3’→5′ exonukleázová aktivita je nukleolytická aktivita proti směru syntézy, tzn. ve většině případů DNA polymeráza touto aktivitou rozkládá řetězec DNA, který sama nasyntetizovala. Proto se této aktivitě také říká „opravná“ (v angličtině „proofreading“).
Naopak 5’→3′ exonukleázová aktivita je směrovaná k řetězci DNA, který leží ve směru syntézy, tzn. DNA polymeráza tento řetězec nejprve rozloží a poté na jeho místě nasyntetizuje nový. 5’→3′ exonukleázové aktivity je využíváno např. při značení DNA, kdy do reakce dodáme značené nukleotidy, které jsou inkorporovány na místo původních.
—————————————————————————————————————————–—————————————————————————————————————————–—————–
DNA POLYMERÁZA I
Jedná se o templát-dependentní DNA polymerázu, která katalyzuje reakci ve směru 5’→3′. Vykazuje rovněž 3’→5′ exonukleázovou („proofreading“) aktivitu a exonukleázovou aktivitu ve směru 5’→3′.
Nejčastější využití
• Značení DNA nick-translací (inkorporace značených nukleotidů např. biotinem, digoxigeninem, atd.)
• Syntéza druhého řetězce cDNA v kombinaci s RNázou H
———————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————–—————–
KLENOWŮV FRAGMENT
Klenowův fragment je fragment DNA polymerázy vykazující 5’→3′ polymerázovou aktivitu a 3’→5′ exonukleázovou (proofreading) aktivitu, ale postrádající 5’→3′ exonukleázovou aktivitu.
Nejčastější využití
• Vytvoření tupých konců doplněním 5’ převisů
• Značení DNA metodou Random-primed DNA labeling (inkorporace značných nukleotidů Cy3-, Cy5, biotinem, digoxigeninem a fluorescenčně značené nukleotidy)
• Značení konců DNA doplněním 5’ převisů
• Sekvenování DNA Sangerovou metodou
• Syntéza druhého vlákna cDNA
———————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————–—————–
T4 DNA POLYMERÁZA
Je templát dependentní DNA polymeráza, která katalyzuje 5′->3′ syntézu. Má 3′->5′ exonukleázovou aktivitu, ale postrádá 5′->3′ exonukleázovou aktivitu.
Nejčastější využití
• Vytvoření tupých konců zaplněním 5’ převisů nebo odstraněním 3’ převisů
• Značení 5’ a 3’ konců DNA
• In vitro mutageneze
———————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————–—————–
T7 DNA POLYMERÁZA
Je templát dependentní DNA polymeráza, která katalyzuje syntézu DNA ve směru 5’->3’. Je vysoce procesivní a umožňuje syntézu dlouhých úseků DNA. Vykazuje také vysokou 3′->5′ exonukleázovou aktivitu vzhledem k jednořetězcové a dvouřetězcové DNA. 3′->5′ exonukleázová aktivita je asi 1000x silnější než stejná aktivita u Klenowova fragmentu.
Nejčastější využití
• Reakce „primer extension“ na dlouhých templátech
• Značení 3’ konců DNA
• Vytvoření tupých konců zaplněním 5’ převisů
• Syntéza druhého vlákna cDNA
———————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————–—————–
TERMINÁLNÍ DEOXYNUKLEOTIDYLTRANSFERÁZA (TdT)
Jedná se o beztemplátovou DNA polymerázu, která katalyzuje opakované přidávání deoxyribonukleotidů k 3’- OH oligodeoxyribonukletidů a jedno- a dvouřetězcové DNA.
Nejčastější využití
• Produkce syntetických homo- a heteropolymerů
• Značení 3’ konců DNA značenými nukleotidy
• 5′-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)