Pro vložení cizí DNA (tzv. inzertu) do plazmidu nejprve plasmid linearizujeme (tj. rozštěpíme jeho kruhovou molekulu). Pro linearizaci se používají restrikční endonukleázy, které štěpí v klonovacím místě vektoru (restrikční štěpení). Tzn. plasmid rozštěpíme v klonovacím místě některou z restrikčních endonukleáz. V závislosti na restriktáze, vzniklé konce mohou být buď tupé („blunt ends“) nebo kohesivní („sticky ends“).
Konce takto linearizovaného plasmidu spojíme s konci vkládaného inzertu, a to pomocí enzymu T4 DNA ligázy (proces je označován jako ligace DNA). Spojované konce musejí být vzájemně kompatibilní, tzn. v případě kohesivních konců musí být konce vektoru štěpené stejným restrikčním enzymem jako konce inzertu. Tupé konce se naproti tomu spojují s jakýmikoliv jinými tupými konci.
Důležité zásady při tradičním klonování:
• Pro štěpení vyberte pouze taková restrikční místa, aby ke štěpení došlo pouze v MCS, tedy ne v inzertu nebo v sekvenci plasmidu mimo MCS!
• Někdy je třeba dbát na správnou orientaci („levo-pravou“) vkládaného inzertu. Jedná se o případy, kdy např. zaklonováváte gen k promotoru již zaklonovaném v daném plasmidu nebo vytváříte fúzní gen.
• Pokud vytváříte konstrukt pro fúzní protein, tedy spojujete dva geny dohromady, je třeba dbát na správný čtecí rámec u obou genů.
• Vyhněte se štěpení s použitím pouze jednoho typu restriktázy a raději štěpení proveďte s dvěma restriktázami tak, aby výsledná molekula linearizovaného plasmidu po štěpení nesla nekompatibilní konce. Pokud je použit jen jeden typ restriktázy, při ligaci dochází preferenčně k recirkularizaci plasmidu, tj. ke vzájemnému spojování konců plasmidu, aniž by došlo k integraci inzertu. Pokud není zbytí a je třeba vektor štěpit pouze jednou restriktázou, je třeba takto rozštěpený vektor defosforylovat. Defosforylace zamezí recirkularizaci prázdného vektoru.
• Pro účinnost ligace je výhodnější mít kohesivní konce, které se ligují účinněji než konce tupé.