Postup při separaci v agarosovém gelu
Potřeby: zdroj elektrického napětí, elektroforetická vana, vanička, hřebínek, agarosa, elektroforetický pufr TAE nebo TBE, nanášecí pufr, velikostní marker (tzv. ladder).
Příprava gelu a elektroforetické vaničky:
- Množství připravovaného gelu závisí na počtu vzorků a tedy velikosti vaničky a délce hřebínku.
- Koncentrace gelu závisí na typu fragmentů DNA, které chceme separovat, viz tabulka. Pro většinu aplikací se ale používá 1% agarozového gelu. Takže např. pro 40 ml 1% agarozového gelu použijeme 40 ml 1X TAE pufru nebo 1X TBE pufru a 0,4 g agarozy.
- Agarózu smícháme s pufrem nejlépe ve skleněné lahvi se šroubovacím víčkem, lahev uzavřeme tak, že je víčko částečně povolené, nebo roztok můžeme připravit v Erlenmayerově bance, přičemž hrdlo přikryjeme plastovou folií, kterou perforujeme pro snadnější odchod páry. Velikost lahve musí být cca 2x větší než je objem připravovaného gelu.
- Agarózu nejsnadněji rozpustíme v mikrovlnné troubě, obvykle stačí 1-1,5 min nebo ji lze rozpustit klasicky na plotýnce. V průběhu rozehřívání můžeme 1-2x roztokem zamíchat. Agaróza musí být dokonale rozpuštěna, tzn. nesmí být patrná žádná zrnka tající agarózy.
- Připravený gel necháme zchladnout tak, aby již nebyl vařící, ale přesto dostatečně horký na to, aby nezačal předčasně tuhnout. Pokud nám gel ale nedopatřením ztuhne, můžeme ho opětovně rozpustit.
- Připravíme si ELFO vaničku, jejíž čela jsme předtím důkladně oblepili lepicí páskou či izolepou (v některých případech jsou vaničky dodávány s kovovými pásky, kterými vaničku utěsníme, či je dodáván jiný „utěsňovací“ systém).Do vaničky vložíme ELFO hřeben a vlijeme agarózový gel, který poté necháme dokonale ztuhnout. Po ztuhnutí odstraníme z vaničky utěsnění a vyndáme hřeben.
- Vaničku usadíme do elektroforetické vany, a to tak, aby jamky byly u záporného pólu. Gel s vaničkou zalijeme 1x ELFO (1x TAE nebo 1x TBE) roztokem. Hladina ELFO roztoku by měla být těsně (1-2 mm) nad gelem.
V některých laboratořích se etidium bromid či jiné barvivo, které nám v závěrečné fázi umožní vizualizaci DNA či RNA, přidává přímo do gelu při jeho přípravě. Nicméně, jelikož jsou etidium bromid a jiná podobná barviva mutageny, z bezpečnostního hlediska (kvůli odpařování a kontaminaci laboratorního prostředí) je doporučováno gel těmito barvivy barvit až po elektroforéze. Rovněž platí, že etidium bromid nepatrně ovlivňuje mobilitu DNA, což není žádoucí u některých experimentů.
Příprava vzorků a jejich nanášení:
- Ke vzorkům přidáme nanášecí pufr. Množství dodaného pufru se odvíjí od jeho koncentrace. Pokud je koncentrace nanášecího pufru 10x, ke vzorkům přidáme pufr o objemu jedné desetiny finálního objemu roztoku. Vzorky promícháme.
- Je výhodné míchat vzorky s nanášecím pufrem na kousku parafilmu místo klasicky ve zkumavce.
- Připravené vzorky naneseme do jamek, přičemž díky přítomnosti glycerolu vzorky klesnou na dno jamky. Aby byly jamky lépe zřetelné, pro snadnější nanášení podložíme elektroforetickou vanu tmavým papírem. Pro nanášení používáme 1-20µl pipety, které mají obvykle jemnější chod než pipety na větší objemy a nanášení vzorků je s nimi tak snadnější.
- Do jedné z jamek rovněž naneseme hmotnostní marker („size marker“ nebo také „ladder“). Objem nanášeného markeru je obvykle doporučen výrobcem.
Separace vzorků:
ELFO vanu přikryjeme víkem a zapneme ELFO zdroj. Nastavíme napětí tak, aby bylo 5-8V/cm mezi elektrodami. Elektroforézu necháme běžet maximálně tak dlouho, až je bromfenolová modř ve 2/3 až ¾ délky vaničky.
Barvení vzorků (pokud nebyla barvička přidaná přímo již do elektroforetického gelu):
- Gel vyjmeme z vaničky a ponoříme ho na 10-20 min do vodného roztoku etidium bromidu (20µl 1%EtBr ve 100ml H2O), případně GelRed či SyberGreenu. Např. zásobní roztok etidium bromidu bývá 1%, tj. 10mg/ml. Pracovní roztok skladujeme ve tmě a lze jej využívat opakovaně.
- Během barvení roztokem protřepáváme.
- Po obarvení opatrně gel z barvícího roztoku vyjmeme, opláchneme vodou a vizualizujeme pod UV světlem. Pro zvýšení kontrastu, lze po ukončení ELFO nežádoucí pozadí odstranit promýváním gelu ve vodě po dobu cca 10 min.