cDNA (complementary cDNA) je DNA syntetizovaná podle mRNA v reakci katalyzované enzymem reverzní transkriptázou. U eukaryotických organismů mRNA vzniká post-transkripční úpravou pre-mRNA, která je syntetizovaná při samotné transkripci genu. Při post-transkripční modifikaci jsou odstraněny introny, je dodána 5’metyl guaninová čepička a při procesu zvaném polyadenylace je také na 3’ konec přidán tzv. poly-A konec. Poly-A konec je úsekem za sebou uspořádaných adenosin monofosfátů. Vzhledem k odstranění intronů při post-transkripční modifikaci, syntézou cDNA získáváme kódující sekvenci daného genu, tj. sekvenci bez intronů.

—————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————-

ZÁKLADNÍ POSTUP PŘI PŘÍPRAVĚ cDNA

Syntéza cDNA se odvíjí v těchto krocích:

  1. krok: Příprava kvalitní RNA nebo mRNA
  2. krok: Samotná syntéza cDNA
  3. krok: Ověření správnosti syntézy pomocí PCR

 

  • Pro iniciaci syntézy jsou jako primery (více informací k primerům najdete zde: PCR – LabGuide.cz (posunemevasvys.cz) využívány poly-dT (komplementární k poly-A na konci každého genu) nebo se využívá směs náhodných hexanukleotidů, nebo i specifické oligonukleotidy, pokud chceme cDNA jen k nějakému konkrétnímu genu a máme nějakou informaci o sekvenci.
  • Činností reverzní transkriptázy se podle molekuly RNA vytváří 1. vlákno cDNA a tím vzniká hybridní dvouvláknová molekula RNA-DNA. Vlákno RNA se odstraní pomocí RNázy H.
  • K 1. vláknu cDNA se syntetizuje 2. vlákno cDNA a tím vzniká dvouvláknová molekula DNA.

—————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————-

REAKČNÍ FÁZE

  1. Denaturace RNA při 65 oC. RNA je denaturována pro odstranění sekundárních struktur na její molekule, které zde mohou být formovány vzhledem k jednořetězcové struktuře RNA.
  2. Syntéza prvního řetězce cDNA. Syntéza probíhá podle řetězce RNA prostřednictvím RT transkriptázy, která pro iniciaci syntézy využívá poly-dT komplementárních k poly-A koncům, případně hexanukleotidy či specifické oligonukleotidy a syntézu provádí pomocí dodaných dNTP (směsi nukleotidů). Výsledkem reakce je DNA-RNA molekula.
  3. Odstranění řetězce RNA z molekuly DNA-RNA. Pro odstranění RNA řetězce je využívána RNasa H.
  4. Syntéza druhého vlákna prostřednictvím PCR. Pro syntézu druhého vlákna je využívaná klasická PCR s primerem specifickým pro cílový úsek.

  POSTUP PŘI PŘÍPRAVĚ cDNA

Uvádíme nejčastěji používaný postup. Nicméně dle doporučení výrobce zvolené reverzní transkriptázy se konkrétní postup může mírně lišit.

 Reakce:

Syntéza 1. vlákna cDNA:

Dle uvedené tabulky připravte směs RNA, primeru, dNTP, doplňte vodou tak, aby objem celé reakce po doplnění všech dalších komponent byl 20 μl.

  Jako templát by měla být používaná RNA bez jakékoliv kontaminace genomovou DNA. Při izolaci RNA se proto doporučuje zahrnout krok s působením DNázy.

  Paralelně s každým testovaným vzorkem připravte vzorek jeho negativní kontroly (tzv. RT(-)). Pro vzorek negativní kontroly použijete všechny komponenty jako použijete u daného vzorku až na reverzní transkriptázu. Při přípravě negativní kontroly zacházíte identickým způsobem jako s testovanými vzorky. Kontrola RT(-) nám ukáže, jestli ve vzorku RNA, který byl použit pro přípravu cDNA, nebyla kontaminace genomovou DNA. Příprava kontroly RT(-) je doporučována zejména, pokud jsou vzorky cDNA využívány ke kvantifikaci transkriptu pomocí kvantitativní Real-time PCR.

 

RNA denaturujte inkubací připravené směsi při 65 oC 5 min., poté rychle vložte na led a nechte inkubovat alespoň 1 min.

Přidejte pufr, DTT, RNase inhibitor a na závěr reverzní transkriptázu. Lehce promíchejte, krátce centrifugujte.

Nechte inkubovat 50 min při 42 oC (teplota a délka inkubace závisí na typu reverzní transkriptázy).

Ukončete reakci inkubací v 70 oC 15 min. Zchlaďte na ledu a centrifugujte.

Přidejte 1 µl RNasy H a inkubujte v 37 oC po 20 min.

Syntéza 2. vlákna cDNA:

Syntéza 2. vlákna cDNA probíhá pomocí standardní PCR s primery k cílovému genu.

  Produkty PCR můžete ověřit elektroforetickou separací a ověříte tak syntézu cDNA. Pokud jste připravovali také negativní kontrolu RT(-), po PCR reakci byste v této negativní kontrole neměli dostat žádný PCR produkt. A pokud vám po PCR v této kontrole produkt vznikne, je to na základě kontaminace genomovou DNA (pozůstatkem genomové DNA ve vzorku RNA).