Spektrofotometrie zahrnuje soubor metod zabývajících se světelným záření a jeho interakcí s různými látkami. Řada látek má totiž schopnost absorbovat světlo o specifických vlnových délkách. Specifičtěji platí, že spektrofotometrie zahrnuje metody, při kterých se měří v širokém rozsahu vlnových délek, ty lze kontinuálně měnit. Na rozdíl od fotometrických metod, při nichž se měří při jedné konkrétní vlnové délce. Těchto metod se využívá zejména v biochemii při stanovování kvalitativního a kvantitativního zastoupení jednotlivých látek například v analytech jako je krev, moč nebo mozkomíšní mok. Dále nacházejí uplatnění při stanovení koncentrace a čistoty vyizolované nukleové kyseliny nebo při imunologických metodách (ELISA aj.).
———————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————-
Spektrofotometr
Přístroj k vyhodnocení spetrofotometrických metod se nazývá spektrofotometr. Obecně se skládá vždy ze 4 hlavních komponent: zdroj světla, monochromátor, zóna pro kyvetu se vzorkem a detektor dopadajících fotonů. Klasické žárovky poskytují světlo v infračervené a viditelné oblasti spektra, vodíkové a deutériové výbojky poskytují záření ultrafialové. Funkcí monochromátoru je propouštět na vzorek světlo pouze o konkrétní vlnové délce (monochromatické záření), nejčastěji se jedná o systém vstupní a výstupní štěrbiny mezi nimiž leží disperzní prvek. Vkládaná kyveta se vzorkem má standardizovaný rozměr 1 cm, tj. její optická dráha je rovna 1 cm. Detektor zaznamenává fotony prošlé vzorkem a signál se pak díky převodnímu systému převádí na výslednou číselnou hodnotu. Absorbance je zpravidla bezrozměrná veličina.
Většinou se nejprve stanovuje slepý vzorek (blank), tzn. vzorek neobsahující stanovovaný analyt. Bývá zahrnuta také ředicí řada pro sestrojení kalibrační křivky, tzn. několik vzorků s daným analytem o známých koncentracích. Nakonec se měří testované neznámé vzorky, na základě naměřené absorbance se odečítá z kalibrační křivky jejich koncentrace. Existují dvoupaprskové spektrofotometry, u kterých lze stanovovat slepý vzorek (tedy referenční) spolu s testovaným neznámým vzorkem zároveň. Mají totiž navíc za monochromátorem tzv. dělič paprsků, jenž rozděluje původní jeden paprsek monochromatického záření ve dva.