Základním hlediskem při výběru metod pro izolaci RNA je to, jestli izolujeme celkovou (totální) RNA nebo pouze mRNA. Vzorek mRNA obsahuje tedy pouze mRNA, naproti tomu vzorek celkové RNA obsahuje kromě mRNA i mnoho dalších typů molekul RNA, jako rRNA, tRNA, různé krátké typy RNA.
Nejčastějším způsobem je izolace celkové RNA. Nicméně v určitých případech (jako je výroba sond pro array analýzu, detekci extrémně vzácné mRNA nebo konstrukce random-primed cDNA knihoven), kdy by celková RNA byla na obtíž, izolujeme mRNA, která tvoří pouze 1 – 5 % totální RNA. Pro izolaci mRNA existují komerčně dostupné kity, kdy se mRNA naváže na oligo dT matrici.
Při izolaci celkové RNA lze využít několik přístupů. V současné době to jsou nejčastěji speciální kolonky, jejichž matrix na sebe naváže RNA z připraveného lyzátu, dále je to metoda využívající fenol-chloroformu (v současné době již málo používaná) a konečně to je i celá řada dalších komerčně dostupných produktů.
———————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————-
DŮLEŽITÁ PRAVIDLA PŘI PRÁCI S RNA
RNA je velice náchylná na působení ribonukleáz (RNáz). Proto obecná zásada při práci s RNA je dodržování čistoty, striktní používání rukavic, špiček s filtrem a vody, která neobsahuje RNázy.
Vodu bez aktivity RNáz lze získat komerčně nebo ji lze připravit v laboratoři pomocí působení dietylkarbonátu.
Kontaminace RNázami vede k degradaci vzorku RNA, což se po izolaci celkové RNA projeví při elektroforetické separaci. Správně izolovaná celková RNA se jeví jako dva celistvé proužky (horní proužek je 28S RNA, dolní je tvořen 18S RNA), ale pokud dojde k degradaci RNA, a to nejčastěji právě působením RNáz, proužky jsou neostré, rozmazané a je zřetelný „ohon“ tvořený molekulami o kratší velikosti. Dlouhodobě lze roztok izolované RNA skladovat při -80 °C.
Pro odstranění případné kontaminace genomovou DNA můžeme roztok RNA ošetřit DNázou. Ošetření DNázou je důležité zejména pokud provádíme kvantifikaci transkripce pomocí PCR a jakákoliv kontaminace genomovou DNáz je v tomto případě vysoce nežádoucí.
Literatura:
Bird IM (2005). „Extraction of RNA from cells and tissue“. Methods Mol. Med. 108: 139–48.
Green M., Sambook J. (2012) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Laboratory Press. 4 vydání. ISBN-10: 1936113422