PCR

POLYMERÁZOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE (PCR)

Polymerázová řetězová reakce (PCR, z anglického Polymerase Chain Reaction) je metoda rychlého zmnožení (amplifikace) vybraného úseku DNA.

 • Množený (amplifikovaný) úsek DNA je ohraničen tzv. primery (oligonukleotidy), což jsou fragmenty DNA o  20 – 25 nukleotidech, které si díky své komplementaritě přisedají právě ke koncům vybraného úseku. Od přisedlých primerů probíhá syntéza DNA.

Samotnou syntézu provádí termostabilní DNA polymeráza, izolovaná nejčastěji z bakterie Thermus aquaticus, odtud označení Taq polymeráza. Jelikož je tento enzym termostabilní, uchovává si svou aktivitu i přes několikeré působení teploty blížící se teplotě varu při probíhající reakci.

  Při reakci je využíváno cyklických změn teplot, které umožňují denaturaci DNA (její rozvolnění na jednořetězce), přisedání primerů a syntézu DNA.

——————————————————————————————————————————-

Princip PCR

Při PCR je využíváno podobného principu, na jakém dochází k syntéze DNA během replikace DNA v buňce:

 DNA polymeráza přisedá k jednořetězcovému (templátovému) úseku DNA. 

 Podle templátového úseku DNA polymeráza syntetizuje druhý, komplementární řetězec.

 DNA polymeráza se při svém startu potřebuje „odrazit“ od krátkého oligonukleotidu (primeru), který je díky své komplementaritě navázán na templátový, jednořetězcový úsek. Syntéza probíhá od místa navázaného primeru.

Při syntéze vzniká z jednořetězcové molekuly dvouřetězcová.

Dvouřetězcová molekula je  následnou denaturací separována na dvě jednořetězcové molekuly, které jsou v dalším kole syntézy DNA polymerázou opět doplněny na dvouřetězcové. 

Tyto kroky se při PCR cyklicky opakují, takže teoreticky např. z původně jedné molekuly DNA po 32 cyklech vzniká 1 miliarda molekul DNA.

PCR schema

——————————————————————————————————————————

Využití PCR

amplifikace DNA

detekce DNA o určité sekvenci ve vzorku (s pomocí využití primerů specifických k dané sekvenci), např. ve forenzní genetice či molekulární diagnostice

kvantifikace na hladině DNA či transkripce

 ——————————————————————————————————————————

Reakční fáze při PCR

 pcr

Denaturace – dvouřetězcová (dvouvláknová) molekula DNA se po dobu 20 – 30 sekund zahřívá na teplotu 94 – 98 °C. Při této teplotě dochází k rozrušení vodíkových můstků v dvouřetězcové molekule DNA a k rozvolnění této dvoušroubovice. Vznikají tak dvě jednořetězcové  (jednovláknové) molekuly DNA, na které mohou v dalším kroku nasednout primery.

   Nasednutí primerů – teplota se sníží na 50 – 65 °C, což umožňuje nasednutí  primerů na specifická místa DNA. Na dvouvláknové úseky DNA/primer se váže DNA polymeráza.

 

Syntéza DNA – teplota použitá v této fázi závisí na použité DNA polymeráze. Nejběžnější Taq polymeráza má optimum aktivity při 72 – 80 °C. V tomto kroku dochází k samotné syntéze DNA. Ve směru od 5′ konce ke 3′ konci přirůstá vlákno DNA komplementární k původní molekule DNA.

 

Tyto kroky se cyklicky opakují. Pro dostatečnou amplifikaci původní molekuly DNA obvykle postačuje 30 cyklů. PCR probíhá v zařízení zvaném termocykler, které je zkonstruováno tak, aby dokázalo během několika sekund zvýšit nebo snížit teplotu o několik desítek stupňů Celsia.

—————————————————————————————————————————-

Základní kroky při provádění PCR

 

1. krok: Znalost sekvence DNA v amplifikovaném úseku (prostřednictvím DNA databází či na základě vlastního sekvenování

2. krok: Navržení sekvence primerů

3. krok: Komerční výroba primerů

4. krok: Výpočet optimální teploty primerů, navržení složení a profilu reakce

5. krok: Provedení reakce

6. krok: Kontrola reakce na elektroforéze (ELFO), případně purifikace reakčního produktu a  sekvenování

—————————————————————————————————————————–

Primery

Primery jsou krátké oligonukleotidy (20 – 25 nt), které jsou komplementární k sekvenci na koncích amplifikovaného úseku. Tzn., že při PCR po denaturaci dvouřetězcové molekuly primery nasedají na konce amplifikované oblasti. Správné primery jsou jedním z klíčových komponent pro správný výsledek PCR.

Délka a sekvence primerů:

Primery jsou obvykle 20-25 nt dlouhé.

Primery v daném páru musí mít srovnatelný počet GC:AT párů. Upřednostňujeme primery s 50 – 60% obsahem GC nebo AT párů.

Sekvence mezi oběma primery nesmí být výrazně komplementární, protože by se primery v reakci párovaly mezi sebou a méně nebo případně vůbec by nenasedaly ke komplementární sekvenci v templátové DNA (vznikaly by tzv. dimery).

 

Rovněž nesmí být komplementarita v rámci sekvence primeru. Došlo by ke vzniku vlásenky (viz. obr.) či jiných sekundárních struktur  a primer by tak nefungoval.

 

Vždy je bezpodmínečně nutné, aby nasedání primerů bylo bezchybné alespoň v 3’ oblasti primeru. LG dimer vlasenka

Navržení primerů

Pro standardní PCR navrhujeme primery v párech – přední, tzv. „forward“ primer a zadní tzv. „reverse“ primer. Primery můžete navrhnout pomocí některého ze softwarů volně dostupných na internetu nebo si je velmi snadno můžete navrhnout „ručně“.

 Při navrhování primerů je třeba si uvědomit, že v běžném zápisu sekvence DNA se zapisuje horní vlákno z dvouřetězcové molekuly DNA, a to ve směru 5’->3’.

 Primery se navrhují podle sekvence horního vlákna, tj. sekvence, která se při běžném zápisu DNA používá. Sekvence předního („forward“) primeru je totožná se sekvencí běžně zapisovaného, tj. horního vlákna. Přední primer umožňuje syntézu horního vlákna podle templátového spodního vlákna.

 Zadní („reverse“) primer se navrhuje jako komplementární sekvence k hornímu vláknu, která je navíc v reverzní orientaci, tzn., že je zapisovaná ve směru 3’->5’. Takže při navrhování sekvence reverse primeru podle horního řetězce, musíme číst sekvenci primeru odzadu. Reverse primer umožňuje syntézu dolního vlákna podle templátového horního vlákna.

 Při navrhování sekvence primeru musíme mít na paměti, že oba primery musí mít aspoň přibližně stejnou teplotu nasedání. Teplotu nasedání primerů lze ovlivnit samotnou sekvencí primerů, resp. GC/AT obsahem a délkou primerů.

  LG nasedani primeru copy

 

 

 

Teplota nasedání primerů (teplota „annealingu“): Od délky primerů a počtu GC párů se odvíjí teplota nasedání primerů.

 Čím  větší délka a vyšší obsah GC párů, tím je teplota nasedání vyšší (viz. přiložená tabulka).

Teplota nasedání primerů musí být dostatečně vysoká, aby nedošlo k nespecifickému nasedání primerů  k templátové DNA, pokud by ale byla příliš vysoká, primery by nenasedaly vůbec.

Je třeba, aby teplota nasedání byla optimální pro oba primery a obsah GC párů v obou primerech byl srovnatelný, tzn., aby byla srovnatelná teplota nasedání obou primerů.

Pro výpočet teploty primerů můžete použít některý ze softwarů volně dostupný na internetu nebo jednodušeji můžete použít naší tabulku.

PCR table

Objednání a výroba primerů: na trhu existuje několik výrobců či dodavatelů primerů, u kterých lze syntézu primerů objednat.

Ředění primerů: Primery přicházejí od výrobce v lyofilizovaném (vysušeném) stavu a je třeba naředit.

Při ředění postupujeme takto:

1. Zkumavku s primerem nejprve krátce centrifugujeme.

2. Primer naředíme na koncentraci 100 pmol/µl (tj. 0,1 mM). Pro ředění používáme sterilní vodu, přednostně používáme špičky s filtrem. Množství vody se odvíjí od množství primeru, které bylo dodáno a které je definováno množstvím molů v protokolu, který výrobce zasílá spolu s primerem.

Příklad. Pokud je výtěžek 21,9 nmol, celý tento výtěžek rozpustíme v 219 µl vody a získáme tak 0,1 mM roztok. Při ředění primeru postupujeme tak, že do zkumavky s primerem přidáme dané množství vody, zkumavku uzavřeme a důkladně zvortexujeme. Získáme tak 0,1 mM (100 pmol/µl) zásobní roztok primeru.

3. Zásobní roztok dále ředíme 10x, tj. do 90 µl vody přidáme 10 µl zásobního roztoku. Získáme tak   10 µM (10 pmol/µl) pracovního roztoku. Roztoky s primery jsou skladovány v -20 °C.

Při ředění primerů můžete využít naší kalkulačku.

 

——————————————————————————————————————————

Objem a složení reakce

Objem reakce: ve většině případů se reakce připravuje v objemu 25-ti µl, ale může se připravovat i v jiných objemech jako 50 µl nebo 100 µl. V některých případech, jako je třeba metoda Klontest, kdy testujeme velké množství vzorků a chceme šetřit materiálem pro PCR a postačuje menší množství produktu, můžeme reakci provádět i v 10 µl.

Složení reakce:

Reakci tvoří tyto komponenty:

Templátová DNA: množství templátové DNA může být nepatrné, příliš velké množství DNA naopak způsobuje v reakci problémy, jako např. nespecifické nasedání primerů.

Primery: obvyklá koncentrace každého z primerů v reakci je 0,1-1 µM (tj. 0,1-1 pmol/µl). Tzn., pokud máme připravený pracovní roztok 10 pmol/µl (tj. 10 µM) (viz. část o ředění primerů), pro 25 µl reakci použijeme 0,25-2,5 µl z obou primerů.  Množství primerů musí být optimální. Příliš vysoká koncentrace vede k nespecifickému nasedání primerů na templátovou DNA nebo párování primerů navzájem. Příliš nízká koncentrace primerů může vést k nedostatečnému množství produktu.

dNTP směs: je směs dATP, dCTP, dGTP a dTTP. Obvyklá koncentrace každého dNTP v reakci je 200 µM (0,2 mM). Množství použité dNTP směsi se odvíjí od koncentrace zásobního roztoku. Většinou je zásobní roztok dNTP směsi o koncentraci 10 mM pro každý dNTP. Tedy pokud připravujeme 100 µl PCR reakci, použijeme 2 µl 10 mM dNTP, u 25 µl reakce použijeme 0,5 µl dNTP.

MgCl2: obvyklá koncentrace je 1,5 mM. MgCl2 je nutný pro procesivitu a přesnost Taq polymerázy. Koncentrace MgCl2 se odvíjí od koncentrace dNTP a platí, že pro specificitu reakce musí koncentrace MgCl2 převyšovat koncentraci dNTP. Pokud máme koncentraci jednotlivých dNTP 200, 400, 600 nebo 800 µl, koncentrace MgCl2 musí být 1,5, 2, 3, 4 nebo 5 mM. Nicméně poměr MgCl2/dNTP lze v určitých případech pozměňovat (viz. Řešení problémů při PCR), kdy pro zvýšení specificity reakce zvyšujeme koncentraci MgCl2, a to až k 5 mM, přičemž koncentraci dNTP držíme stále na stejné úrovni. Někteří výrobci Taq polymerázy dodávají MgCl2 zahrnuté do reakčního pufru.

Reakční pufr: obvyklé složení je 50 mM KCl a 10 mM Tris-HCl, pH 8,3. Reakční pufry jsou dodávány spolu s Taq polymerázou jako 10x koncentrované. Tzn. pro 25 µl reakci použijeme 2,5 µl dodaného pufru. Reakční pufr dodá reakci potřebnou koncentraci solí a potřebné pH.  Koncentrace solí ovlivňuje specificitu reakce, protože ovlivňuje specificitu nasedání primerů. U některých výrobců reakční pufr obsahuje rovnou i 1,5 mM MgCl2.

Taq polymeráza: Množství enzymu, které by mělo být dodáno do reakce je stanoveno v manuálu od výrobce. Nicméně, obvykle je toto množství 0,1-0,25  µl na 25  µl reakci.

H2O: voda musí být sterilní a purifikovaná. Vodou doplňujeme reakci na požadovaný objem.

Všechny komponenty jsou skladovány v -20 °C.

—————————————————————————————————————————–

Reakce

Reakce se obvykle provádí ve 30 cyklech. Každý cyklus je tvořen denaturací, nasedáním primerů a syntézou. Cyklickou reakci předchází úvodní denaturace a ukončuje závěrečná extenze.

Obecně reakce běží jako:  Úvodní denaturace [Denaturace – Nasedání primerů – Extense]30X Závěrečná extense

Úvodní denaturace: je důležitá především u genomové DNA, a to vzhledem k její délce. Dostatečná délka úvodní denaturace zajistí, že dvouvlákna DNA jsou pro reakci plně rozpletena. Provádí se při teplotě 95 °C po dobu 3 – 5 min. Při dalších cyklech PCR stačí již krátké časy denaturace, protože v reakci je již přítomna templátová DNA vzniklá z prvního cyklu reakce, která bývá o dostatečně krátké velikosti a je tedy snadno denaturovatelná.

Denaturace: se provádí při 95 °C 0,5 – 1 min

Nasedání primerů („annealing“) – teplota závisí na sekvenci primerů (viz. tabulka). Doba nasedání je obvykle 30 s, ale může se dle potřeby měnit. Zvýšením doby nasedání primeru můžeme zvýšit výtěžek reakce, ale zároveň také můžeme snížit specificitu nasedání primerů, a naopak.

Extense: se provádí při 72 °C, délka závisí na rychlosti polymerázy (informace od výrobce) a délce produktu. Obvykle, pokud je délka produktu 100 – 800 bp, extense je 30 s, do 1,5 kb je extense 1 min.

Závěrečná extense: se provádí při 72 °C 4 min. Tato fáze zajistí, že všechny produkty jsou plně dosyntetizovány.

Pro většinu aplikací můžeme doporučit toto obecné schéma profilu PCR:

schema profilu cr

  —————————————————————————————————————————–

Příprava reakce

  Reakci připravujeme na ledu, tzn. všechny komponenty a reakční směsi máme na ledu, a to kromě Taq polymerázy. Taq polymerázu máme buď ve speciálním stojánku, který udržuju teplotu okolo -20 0C nebo ji vyndáme z mrazáku  těsně před použitím a umístíme ji na led a hned po použití ji vrátíme zpět do  -20 0C.

Pro zamezení kontaminace používáme preferenčně špičky s filtrem .

Používáme negativní a pozitivní kontrolu, pokud je to možné. V negativní kontrole použijeme místo testovaného vzorku vodu, tzn., negativní kontrola neobsahuje testovanou DNA. Pozitivní kontrola naopak obsahuje takovou DNA, která nám zajistí vznik požadovaného produktu.

Pokud připravujeme více vzorků, připravíme si tzv. „master mix“. Tzn., pokud připravujeme 25 µl reakcí pro deset různých vzorků DNA, reakční směs si namícháme najednou pro všechny vzorky kromě DNA. Vždy počítáme s jednou reakcí navíc (někdy se stane, že kvůli nepřesnosti pipetování nezbyde pro poslední vzorek  dostatek reakční směsi). Takže, pokud budeme provádět reakci pro 10 vzorků, počítáme reakční komponenty pro 11 vzorků. Takže např. místo 1 µl primeru (který bychom dávali na jednu reakci) přidáme do „master mixu“ 11 µl primeru, místo 2 µl dNTP směsi (kterou bychom dávali na jednu reakci) přidáme 22 µl dNTP směsi, atd. Připravenou reakci důkladně promícháme a rozpipetujeme do připravených PCR zkumavek, do kterých poté přidáme testovanou DNA.

Pro PCR reakce používáme speciální, tenkostěnné zkumavky na PCR.

Příklad přípravy PCR reakce:

pcr reakce