Extrakce DNA z gelu

EXTRAKCE DNA Z GELU

 K určitým účelům potřebujeme DNA extrahovat z gelu po proběhlé elektroforetické separaci. Jedná se o poměrně jednoduchou metodu, která se provádí v zásadě ve třech krocích:

Z gelu pod UV světlem vyřízneme daný proužek DNA. Pro excizi používáme skalpel, žiletku, případně kopistku.

Vyříznutý bloček agarosy obsahující naší DNA inkubujeme s extrakčním roztokem obvykle při 55°C, dokud se agarosa nerozpustí.

DNA z vyříznutého gelu následně extrahujeme pomocí některého z komerčně dostupných produktů, které jsou založeny na separaci pomocí kolonek s DNA-vazebnou matrix, nebo využijeme protokol na bezkolonkovou extrakci uváděnou dále.

vykricnik Při excizi DNA z gelu dbáme na dvě věci: jednak bezpodmínečně máme ochranný štít či brýle proti UV, za druhé pracujeme urychleně, protože působením UV vznikají na DNA tyminové dimery, které by mohly způsobovat problémy v následných experimentech.

————————————————————————————————————————————–

BEZKOLONKOVÁ METODA EXTRAKCE DNA Z GELU

Tato metoda je založena na navázání extrahované DNA na silikonové částice. Provádí se v těchto krocích:

Fragment DNA je po elektroforetické separaci vyřezán pod UV lampou s využitím kopistky nebo žiletky či skalpelu.

Vyřezaný bloček je zvážen a vložen do 1,5 ml zkumavky.

Na každý miligram váhy bločku se přidá 2,5 μl roztoku NaI, tj. například 250 μl NaI na 100 mg bloček.
K roztoku se přidá důkladně promíchané silica milk (Sigma) , a to v množství:

  – 5 μl silica milk, pokud fragment DNA odhadujeme v množství do 1 μg (1 μg DNA se jeví jako zřetelný proužek na gelu)

– 10 μl silica milk, pokud fragment DNA odhadujeme v množství mezi 1 – 3 μg (velmi jasný proužek na gelu)

 – při každý dalších 3 μg se přidá dalších 10 μl silica milk

 

Roztok se promíchá a nechá stát na ledu 5-15 min. Poté se roztok krátce (10s) centrifuguje.

Silica milk s navázanou DNA se promývá ve 200 -500 μl promývacího roztoku, a to celkem 3x. Při promývání se vždy sediment rozmíchá špičkou, krátce se centrifuguje (5s) a supernatant se vyleje.Závěrem promývání se roztok centrifuguje (30s) a odstraní se zbytek supernatantu.

Přidá se 10 μl (při větším množství extrahované DNA se přidá stejný objem, jaký mělo silica milk) vody nebo TE pufru.

 

Roztok se inkubuje při 55 °C, 3 minuty. Centrifuguje se 1 min, odebere se supernatant, tj. roztok s DNA.

 

Příprava silica milk (100 mg/ml):

Smícháme 1 g silikonových částeček (Sigma S5631) s 10 ml 1X PBS. Protřepeme a necháme sedimentovat 2 hod. Supernatant vylejeme, sediment znovu smícháme s 10 ml 1X PBS a opakujeme usazení. Supernatant vylejeme, centrifugujeme při 2000 rpm, 2 min. Vylijeme zbytek supernatantu a sediment rozmícháme v 10 ml 3M NaI. Skladujeme v temnu při 4°C.

NaI (6M)

Rozpustíme 0,75 g Na2SO3 ve 40 ml vody. Přidáme 45 g NaI a mícháme do rozpuštění. Filtrujeme a skladujeme v temnu při 4°C, a to nejdéle 4 měsíce.

Promývací roztok: 20mM Tris, pH7,4, 1mM EDTA, 100 mM NaCl, 50% etanol. Skladujeme v -20°C.