Problémy při hybridizaci se týkají především buď vysokého pozadí, tj. přítomnosti silného nespecifického signálu, nebo naopak příliš nízkého specifického signálu.
Při hybridizačních technikách bychom měli dbát na několik zásad:
• Všechny roztoky při hybridizačních technikách by měly být připraveny z purifikované vody a mělo by být používáno čisté nádobí. Zvláště voda znečištěná organickým obsahem může způsobovat vysoké pozadí.
• S membránou by mělo být zacházeno opatrně, v rukavicích a manipulovat s ní pokud možno čistými pinzetami, těmi membránu uchopovat nejlépe za rohy nebo okraje.
• Teplota při hybridizaci a při promývacích krocích by měla být precizně kontrolovaná, používané roztoky by měly být předem vytemperované na požadovanou teplotu.
• Při přenosu na membránu by měly být odstraněny veškeré bubliny, které se mohou objevit pod či nad membránou.
• Při radioaktivním značení lze při posledním promývacím kroku míru pozadí monitorovat Geigerovým počítačem. Pokud je v místech na membráně, kde není očekáván specifický radioaktivní signál, zaznamenána vysoká míra radioaktivity, svědčí to o vysoké míře pozadí. V tom případě je možno pokračovat dalšími promývacími kroky.
—————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————-
VYSOKÉ NESPECIFICKÉ POZADÍ
Nejčastější důvody:
• Roztoky nemají požadovanou teplotu (nebyly předem vytemperovány).
• Vysoká koncentrace sondy.
• Sonda nebyla přečištěna od neinkorporovaných nukleotidů po značení.
• Nedostatečná prehybridizace.
• Hybridizační či promývací podmínky nejsou dostatečně stringentní.
• Zaschnutí hybridizačních či promývacích roztoků na membráně.
• Zbytky agarosy na membráně – membrána by měla být dostatečně opláchnuta v 2X SSC před fixací.
Nejčastější řešení:
• Příliš nízká teplota – zvyšte teplotu při hybridizaci a promývacích krocích.
• Příliš vysoká koncentrace solí – snižte koncentraci solí při promývacích krocích.
• Zvyšte koncentraci SDS.
• Prodlužte dobu promývání.
NEDOSTATEČNÝ HYBRIDIZAČNÍ SIGNÁL
Nejčastější důvody:
• Nedostatečná detekce (příliš malé množství substrátu, nedostatečná expozice při snímání CCD kamerou).
• Nedostatečný transfer na membránu.
• Nízká koncentrace DNA/RNA na membráně.
• Nedostatečná koncentrace sondy.
• Nízká nebo chybějící homologie mezi sondou a cílovým úsekem.
• Dvouřetězcová sonda nebyla dostatečně denaturovaná.
• Sonda byla špatně naznačená.
• Doba hybridizace byla krátká.
• Hybridizační či promývací podmínky jsou příliš stringentní.
Nejčastější řešení:
• Zvýšení množství vzorku.
• Zvýšení koncentrace sondy nebo zahrnutí 10% dextran sulfátu.
• Snížení teploty při hybridizaci a promývacích krocích.
• Zvýšení koncentrace solí při promývacích krocích.
• Prodloužení doby promývání.
• Snížení koncentrace SDS.
• Zkrácení doby promývání.
• Optimalizace značení sondy či transferu na membránu.