Problémy při hybridizaci se týkají především buď vysokého pozadí, tj. přítomnosti silného nespecifického signálu, nebo naopak příliš nízkého specifického signálu.

Při hybridizačních technikách bychom měli dbát na několik zásad:

 Všechny roztoky při hybridizačních technikách by měly být připraveny z purifikované vody a mělo by být používáno čisté nádobí. Zvláště voda znečištěná organickým obsahem může způsobovat vysoké pozadí.

S membránou by mělo být zacházeno opatrně, v rukavicích a manipulovat s ní pokud možno čistými pinzetami, těmi membránu uchopovat nejlépe za rohy nebo okraje.

Teplota při hybridizaci a při promývacích krocích by měla být precizně kontrolovaná, používané roztoky by měly být předem vytemperované na požadovanou teplotu.

Při přenosu na membránu by měly být odstraněny veškeré bubliny, které se mohou objevit pod či nad membránou.

Při radioaktivním značení lze při posledním promývacím kroku míru pozadí monitorovat Geigerovým počítačem. Pokud je v místech na membráně, kde není očekáván specifický radioaktivní signál, zaznamenána vysoká míra radioaktivity, svědčí to o vysoké míře pozadí. V tom případě je možno pokračovat dalšími promývacími kroky.

—————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————-

VYSOKÉ NESPECIFICKÉ POZADÍ

Nejčastější důvody:

Roztoky nemají požadovanou teplotu (nebyly předem vytemperovány).

Vysoká koncentrace sondy.

Sonda nebyla přečištěna od neinkorporovaných nukleotidů po značení.

Nedostatečná prehybridizace.

Hybridizační či promývací podmínky nejsou dostatečně stringentní.

Zaschnutí hybridizačních či promývacích roztoků na membráně.

Zbytky agarosy na membráně – membrána by měla být dostatečně opláchnuta v 2X SSC před fixací.

 

Nejčastější řešení:

Příliš nízká teplota – zvyšte teplotu při hybridizaci a promývacích krocích.

Příliš vysoká koncentrace solí – snižte koncentraci solí při promývacích krocích.

Zvyšte koncentraci SDS.

Prodlužte dobu promývání.

 

NEDOSTATEČNÝ HYBRIDIZAČNÍ SIGNÁL

Nejčastější důvody:

Nedostatečná detekce (příliš malé množství substrátu, nedostatečná expozice při snímání CCD kamerou).

Nedostatečný transfer na membránu.

Nízká koncentrace DNA/RNA na membráně.

Nedostatečná koncentrace sondy.

Nízká nebo chybějící homologie mezi sondou a cílovým úsekem.

Dvouřetězcová sonda nebyla dostatečně denaturovaná.

Sonda byla špatně naznačená.

Doba hybridizace byla krátká.

Hybridizační či promývací podmínky jsou příliš stringentní.

 

Nejčastější řešení:

Zvýšení množství vzorku.

Zvýšení koncentrace sondy nebo zahrnutí 10% dextran sulfátu.

Snížení teploty při hybridizaci a promývacích krocích.

Zvýšení koncentrace solí při promývacích krocích.

Prodloužení doby promývání.

Snížení koncentrace SDS.

Zkrácení doby promývání.

Optimalizace značení sondy či transferu na membránu.