Oligo klonování slouží k inzerci krátkých oligonukleotidů do stávajících vektorů. Pokud máme nějaký náš oblíbený vektor, který ovšem nenese dostatečná restrikční místa, můžeme MCS tohoto vektoru obohatit o nová restrikční místa právě oligo klonováním.
• Princip metody tkví v tom, že si necháme některou z dostupných firem vyrobit dva k sobě komplementární oligonukleotidy, které nesou potřebná restrikční místa.
• Oligonukleotidy ovšem musí na svých koncích obsahovat ještě krátkou dodatečnou sekvenci, která po vzájemné hybridizaci oligonukleotidů poskytne jednořetězcové převisy.
• Jednořetězcové převisy musí být komplementární ke koncům cílového vektoru (vzniklých štěpením příslušnou restriktázou) a umožní tak integraci oligonukleotidu do tohoto vektoru.
Obrázek: Pro oligo klonování si necháme vyrobit krátké oligonukleotidy (1), které po vzájemné hybridizaci vytváří dvouřetězcovou molekulu s jednořetězcovými převisy na svých koncích (2). Jednořetězcové převisy fungují jako komplementární sekvence s konci vektoru. Vektor je naštěpen danými restrikčními enzymy (3) a je spojen s připraveným dvouřetězcovým oligonukleotidem (4).
————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————
Postup při oligo klonování
1. Navrhněte oligonukleotidy a nechte je vyrobit v některé z komerčních společností.
2. Dodané oligonukleotidy resuspendujte v hybridizačním pufru (10 mM Tris, pH 7.5-8.0, 50mM NaCL, 1 M EDTA) a smíchejte v ekvimolární koncentraci, nejlépe 2 μg z každého oligonukleotidu v 50 μl objemu.
3. Směs zahřejte na 90-95 oC po dobu 5 min, poté 45 min inkubujte při pokojové teplotě.
4. K 5 μl směsi nukleotidů přidejte 45 μl vody. Koncentrace by měla být cca 8 ng/μl.
5. V poměru 4:3 až 6:1 smíchejte oligonukleotidy s vektorem, který byl předtím rozštěpen vybranými restriktázami. Tj. ke 100 ng vektoru přidejte 75 až 600 ng oligonukleotidů.
6. Přidejte T4DNA ligázu, pufr. Ligační reakci proveďte standardně.