IZOLACE DNA POMOCÍ GRAVITAČNÍCH KOLONEK
Izolace pomocí komerčně dostupných gravitačních kolonek je v současné době nejčastějším způsobem izolace genomové DNA. Jedná se o rychlou a účinnou metodu poskytující DNA o dostatečné čistotě pro většinu aplikací. Na trhu je k dispozici celá řada kolonkových kitů sloužících k izolaci genomové DNA.
————————————————————————————————————————————–
ZÁKLADNÍ POSTUP PŘI IZOLACE DNA POMOCÍ GRAVITAČNÍCH KOLONEK
• Lyzát, který se ponejprv získá rozrušením tkání a buněk, a působením proteázy se nanese do
speciální kolonky.
• V kolonce je přítomna matrix, na kterou se dodaná DNA naváže a centrifugací kolonky se
roztok (bez DNA) odplaví pryč.
• Matrix s navázanou DNA se promyje promývacím roztokem. Promývací roztok je odplaven z
kolonky následnou centrifugací.
• Po promytí se DNA z matrix vyváže centrifugací s vodou či elučním pufrem. DNA je takto
odplavena z matrix do připravené sběrné zkumavky.
U kolonkových kitů je důležité brát v úvahu tyto parametry:
• pro jaký druh vstupního materiálu je kit určen (krev, tkáň, rostliny)
• vstupní množství materiálu – na trhu jsou také kity optimalizované pro množství výtěžků, tj. kity
pro použití při malých, středních a velkých vstupních množství materiálu
• výtěžek se pohybuje řádově většinou desítky µg DNA / RNA
• délka protokolu (většinou cca 30 min – 1 hodina)
• vazebná kapacita kolonky – většinou cca 50 µg
• čistota výtěžku (A260/A280) – udává kontaminaci proteiny (výrobci kitů udávají většinou 1,6 –
1,9)
