K určitým účelům potřebujeme DNA extrahovat z gelu po proběhlé elektroforetické separaci. Jedná se o poměrně jednoduchou metodu, která se provádí v zásadě ve třech krocích:

  • Z gelu pod UV světlem vyřízneme daný proužek DNA. Pro excizi používáme skalpel, žiletku, případně kopistku.
  • Vyříznutý bloček agarosy obsahující naši DNA inkubujeme s extrakčním roztokem obvykle při 55°C, dokud se agarosa nerozpustí.
  • DNA z vyříznutého gelu následně extrahujeme pomocí některého z komerčně dostupných produktů, které jsou založeny na separaci pomocí kolonek s DNA-vazebnou matrix, nebo využijeme protokol na bezkolonkovou extrakci uváděnou dále.

  Při excizi DNA z gelu dbáme na dvě věci: jednak bezpodmínečně máme ochranný štít či brýle proti UV, za druhé pracujeme urychleně, protože působením UV vznikají na DNA tyminové dimery, které by následně mohly způsobovat problémy v následných experimentech.

———————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————————-

BEZKOLONKOVÁ METODA EXTRAKCE DNA Z GELU

Tato metoda je založena na navázání extrahované DNA na silikonové částice. Provádí se v těchto krocích:

  1. Fragment DNA je po elektroforetické separaci vyřezán pod UV lampou s využitím kopistky nebo žiletky či skalpelu.
  2. Vyřezaný bloček je zvážen a vložen do 1,5 ml zkumavky. Na každý miligram váhy bločku se přidá 2,5 μl roztoku NaI, tj. například 250 μl NaI na 100 mg bloček.
  3. Provede se inkubace bločku v NaI při 55 °C po dobu 3 – 5 minut, pokud možno za konstantního protřepávání tak, aby se agarosa rozpustila. Po dokonalém rozpuštění agarosy je roztok protřepán. K roztoku se přidá důkladně promíchané silica milk, a to v množství:
    • 5 μl silica milk, pokud fragment DNA odhadujeme v množství do 1 μg (1 μg DNA se jeví jako zřetelný proužek na gelu)
    • 10 μl silica milk, pokud fragment DNA odhadujeme v množství mezi 1 – 3 μg (velmi jasný proužek na gelu)
    • při každý dalších 3 μg se přidá dalších 10 μl silica milk
  1. Roztok se promíchá a nechá stát na ledu 5 – 15 min. Poté se roztok krátce (10s) centrifuguje.
  2. Silica milk s navázanou DNA se promývá ve 200 – 500 μl promývacího roztoku, a to celkem 3x. Při promývání se vždy sediment rozmíchá špičkou, krátce se centrifuguje (5s) a supernatant se vylije.
  3. Závěrem promývání se roztok centrifuguje (30s) a odstraní se zbytek supernatantu.
  4. Přidá se 10 μl (při větším množství extrahované DNA se přidá stejný objem, jaký mělo silica milk) vody nebo TE pufru.
  5. Roztok se inkubuje při 55 °C 3 minuty. Centrifuguje se 1 min, odebere se supernatant, tj. roztok s DNA.

 

Příprava silica milk (100 mg/ml):

Smícháme 1 g silikonových částeček (Sigma S5631) s 10 ml 1X PBS. Protřepeme a necháme sedimentovat 2 hod. Supernatant vylijeme, sediment znovu smícháme s 10 ml 1X PBS a opakujeme usazení. Supernatant opět vylijeme, centrifugujeme při 2000 rpm 2 min. Vylijeme zbytek supernatantu a sediment rozmícháme v 10 ml 3 M NaI. Skladujeme v temnu při 4 °C.

NaI (6 M)

Rozpustíme 0,75 g Na2SO3 ve 40 ml vody. Přidáme 45 g NaI a mícháme do rozpuštění. Filtrujeme a skladujeme v temnu při 4 °C, a to nejdéle 4 měsíce.

Promývací roztok: 20mM Tris, pH = 7,4, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 50% etanol. Skladujeme v -20 °C.