Dot Slot/Blot hybridizace se využívá k detekci hledané sekvence DNA ve vzorku. Na rozdíl od Southernovy či Northernovy hybridizace není vzorek nukleové kyseliny elektroforeticky separován, ale pouze se formou kapky nanese přímo na hybridizační membránu, kde se pak standardně imobilizuje UV či teplem a provádí se hybridizace a detekce jako v případě Southernovy či Northernovy hybridizace.

 

Imobilizace vzorků na membráně

Vzorky DNA jsou nejprve pro získání jednovláknových molekul denaturovány, a to zahřátím na 100 °C, po dobu 5 min a následně rychlým zchlazením přeneseny na led, kde jsou vzorky inkubovány alespoň 3 min.

Denaturovaná DNA je pipetou v kapkách o 1-2 μl nanesena na membránu. Vzorky na membráně fixujeme pomocí UV buď přímo v UV crosslinkeru nebo 3 min na transiluminátoru, alternativně 30-60 min při 120°C.

S membránou manipulujeme zásadně v rukavicích. Nejlépe membránu držíme za její okraje pinzetou.

 

 

 

Hybridizace

Suchou nylonovou membránu navlhčíme ponořením do vody. Přeneseme membránu do 0,1X SSC/0,5% SDS. Inkubujeme při 65°C na 1 hodinu.

 

Membránu vložíme do prehybridizačního roztoku předehřátého na 65°C. Na každý 1 cm2 membrány použijeme alespoň 100 ul prehybridizačního roztoku. Inkubujeme za stálého promíchávání při 65 °C, 2 hodiny.

Prehybridizace a hybridizace mohou být prováděny v hybridizačních válcích nebo vhodných plastových nádobách nebo také igelitových pytlících, jejichž okraje jsou utěsněny zavařením nebo zalepením (využití igelitových pytlíků je výhodné, pokud prehybridizujeme/hybridizujeme v malých objemech roztoků).

 

Prehybridizační roztok *



* skladováno v alikvotech v -20°C, před použitím přidejte denaturovanou DNA lososích spermií a temperujte na 65°C

** do roztoku se přidává až před použitím. Před přidáním se DNA lososích spermií denaturuje zahřátím na 95°C, 5 min a poté prudkým zchlazením uložením na led na minimálně 1 minutu

 

  Prehybridizační roztok vyměníme za hybridizační roztok, který jsme předem vytemperovali na 65 °C a přidali jsme denaturovanou sondu. Denaturace sondy se provádí zahřátím sondy na 95°C  po dobu 5 min. a následně jejím rychlým zchlazením, a to přenesením zkumavky na led na 3 min. Množství přidávané sondy se odvíjí od způsobu značení. Pokud je sonda značená 32P, obvykle přidáváme tolik sondy, aby výsledná koncentrace byla 2 x 106 cpm/ml (může být v rozmezí od 0,5 x 106 až 3 x 106 cpm/ml). Pokud je sonda značena neradioaktivně, řídíme se doporučením výrobce značícího systému.

 

Hybridizační roztok*

* skladováno v alikvotech v -20°C, před použitím přidejte denaturovanou DNA lososích spermií a temperujte na 65°C

** do roztoku se přidává až před použitím. Před přidáním se DNA lososích spermií denaturuje zahřátím na 95°C, 5 min a poté prudkým zchlazením uložením na led na minimálně 1 minutu

 

Hybridizaci provádějte 12-16 hod při teplotě:

u většiny dlouhých sond (>100 bazí) 65-68 °C

u krátkých/oligo sond (< 50 b) je hybridizační teplota o 5 °C nižší než je teplota Tm. Teplota Tm = 4x počet GC párů + 2x počet AT párů

 

Posthybridizační promývání

Membrána je promývána nízko-stringentními podmínkami, pokud očekáváme, že sonda není úplně identická s cílovou sekvencí. V opačném případě používáme vysoce-stringentní podmínky.

Při vysoce-stringentních podmínkách:

Promyjeme membránu v promývacím roztoku I (2X SSC/0,1% SDS), při pokojové teplotě 5 min, za konstantního promíchávání.

Promývací roztok I nahradíme promývacím roztokem II (0,1x SSC/0,1% SDS). Promýváme při 65°C, 10 min. Tento promývací krok 1-2x opakujeme.

Při nízko-stringentních podmínkách:

Pro promývání s nízko-stringentními podmínkami se využívá pouze 2x SSC/0,1% SDS, teplota je určena empiricky, kdy jako nejnižší je použita 37°C.

 

Detekce sondy

Proveďte detekci sondy buď autoradiograficky v případě radioaktivně značené sondy nebo jiným systémem dle způsobu značení sondy.

 

Odstranění sondy navázané na membráně pro opětovné použití membrány

Nylonové membrány mohou být použity 10-30x. Suchá membrána může být uskladněna při pokojové teplotě.

Vložte membránu do roztoku 0,2N NaOH a za konstantního promíchávání inkubujte 10 min. Použijte cca 1-2 ml NaOH na každý 1cm2. Odstraňte NaOH.

Promyjte membránu 3x v 0,1 SSC/0,1% SDS/50 mM Tris-HCl (pH 7,5), po 5 min. Použijte cca 1-2 ml roztoku na každý 1cm2. Monitorujte pH promývacího roztoku po mocí pH papírku. Pokud roztok není neutrální, opakujte promývací kroky.

  

 

Alternativní prehybridizační a hybridizační roztoky

Alternativně mohou být pro prehybridizaci a hybridizaci použity roztoky s přídavkem formamidu, který snižuje teplotu tání DNA. Tímto může být hybridizace prováděna při 42°C.

 Prehybridizační roztok s formamidem*

* skladováno ve  4°C, délka skladovatelnosti 4 max. 4 měsíce, před použitím přidejte denaturovanou DNA lososích spermií a temperujte na 65°C

** do roztoku se přidává až před použitím. Před přidáním se DNA lososích spermií denaturuje zahřátím na 95°C, 5 min a poté prudkým zchlazením uložením na led na minimálně 1 minutu

 

Hybridizační roztok s formamidem*:

* skladováno ve  4°C, délka skladovatelnosti 4 max. 4 měsíce, před použitím přidejte denaturovanou DNA lososích spermií a temperujte na 65°C

** do roztoku se přidává až před použitím. Před přidáním se DNA lososích spermií denaturuje zahřátím na 95°C, 5 min a poté prudkým zchlazením uložením na led na minimálně 1 minutu

 

Příprava 1M fosfátu sodného (pH 6,7)

Rozpustíme 14,196 g NaH2PO4 v 80 ml vody. Upravíme pH na 6,7 pomocí kyseliny fosforečné a doplníme do 100 ml.