Colony blot hybridizace slouží k detekci dané sekvence DNA v jednotlivých koloniích baktérií.

Technika se sestává z těchto kroků:

  • přenesení a imobilizace vzorků kolonií na membránu
  • příprava vzorků na hybridizaci
  • hybridizace a posthybridizační promývání
  • detekce

——————————————————————————————————————————————————————————————————————————————-

IMOBILIZACE VZORKŮ NA MEMBRÁNĚ

Nechejte narůst bakterie na Petriho misce s živným médiem do počtu 50-100 kolonií na misku a velikosti kolonií 0,5-1 mm v průměru. Vystřihněte nylonovou membránu do velikosti Petriho misky a opatrně ji přitlačte na misku s testovanými koloniemi. Pro určení orientace propíchěte sterilním špendlíkem membránu a živné médium na třech místech. Sejměte membránu a vzorky nahoru ji postupně pokládejte na filtrační papíry nasáknuté v daných roztocích a nechte inkubovat dle tabulky:

  S membránou manipulujeme zásadně v rukavicích. Nejlépe membránu držíme za její okraje pinzetou.

Membránu položíme na suchý filtrační papír, necháme sušit 30 minut. Poté vzorky na membráně fixujeme pomocí UV buď přímo v UV crosslinkeru, nebo 3 min na transiluminátoru, alternativně na 30 – 60 min při 120 °C.

Membrána je v tomto kroku připravena pro hybridizaci, alternativně může být zabalena do plastové fólie a uchována v +4 °C pro pozdější použití.

——————————————————————————————————————————————————————————————————————————————-

HYBRIDIZACE

  • Suchou nylonovou membránu navlhčíme ponořením do purifikované vody. Přeneseme membránu do 0,1X SSC/0,5% SDS. Inkubujeme při 65 °C 1 hodinu.
  • Membránu vložíme do prehybridizačního roztoku předehřátého na 65 °C. Na každý 1cm2 membrány použijeme alespoň 100 µl prehybridizačního roztoku. Inkubujeme za stálého promíchávání při 65 °C 2 hodiny.

Prehybridizace a hybridizace mohou být prováděny v hybridizačních válcích nebo vhodných plastových nádobách nebo také igelitových pytlících, jejichž okraje jsou utěsněny zavařením nebo zalepením (využití igelitových pytlíků je výhodné pokud prehybridizujeme/hybridizujeme v malých objemech roztoků).

Prehybridizační roztok*

 

* skladováno v alikvotech v -20°C, před použitím přidejte denaturovanou DNA lososích spermií a temperujte na 65 °C

** do roztoku se přidává až před použitím. Před přidáním se DNA lososích spermií denaturuje zahřátím na 95 °C 5 min a poté prudkým zchlazením uložením na led na minimálně 1 minutu

 

  • Prehybridizační roztok vyměníme za hybridizační roztok, který jsme předem vytemperovali na 65 °C a přidali jsme denaturovanou sondu. Množství přidávané sondy se odvíjí od způsobu značení. Pokud je sonda značená 32P, obvykle přidáváme tolik sondy, aby výsledná koncentrace byla  2 x 106 cpm/ml (může být v rozmezí od 0,5 x 106 až 3 x 106 cpm/ml). Pokud je sonda značena neradioaktivně, řídíme se doporučením výrobce značícího systému.

Hybridizaci provádějte 12 – 16 hod při teplotě:

  • u většiny dlouhých sond (>100 bazí) 65 – 68 oC
  • u krátkých/oligo sond (< 50 b) je hybridizační teplota o 5 oC nižší než je teplota Tm.

Teplota Tm = 4x počet GC párů + 2x počet AT párů

 

Hybridizační roztok*

* skladováno v alikvotech v -20 °C, před použitím přidejte denaturovanou DNA lososích spermií a temperujte na 65 °C

** do roztoku se přidává až před použitím. Před přidáním se DNA lososích spermií denaturuje zahřátím na 95 °C 5 min a poté prudkým zchlazením uložením na led na minimálně 1 minutu

——————————————————————————————————————————————————————————————————————————————-

POSTHYBRIDIZAČNÍ PROMÝVÁNÍ A DETEKCE

Membrána je promývána nízko-stringentními podmínkami (odkaz), pokud očekáváme, že sonda není úplně identická s cílovou sekvencí. V opačném případě používáme vysoce-stringentní podmínky (odkaz).

 

Při vysoce-stringentních podmínkách:

Promyjeme membránu v promývacím roztoku I (2X SSC/0,1% SDS), při pokojové teplotě 5 min, za konstantního promíchávání.

Promývací roztok I nahradíme promývacím roztokem II (0,1x SSC/0,1% SDS). Promýváme při 65 °C 10 min. Tento promývací krok 1-2x opakujeme.

Při nízko-stringentních podmínkách:

Pro promývání s nízko-stringentními podmínkami se využívá pouze 2x SSC/0,1% SDS, teplota je určena empiricky, kdy jako nejnižší je použita 37 °C.

 

Proveďte detekci sondy buď autoradiograficky v případě radioaktivně značené sondy, nebo jiným systémem dle způsobu značení sondy.

 

——————————————————————————————————————————————————————————————————————————————-

ODSTRANĚNÍ SONDY NAVÁZANÉ NA MEMBRÁNĚ PRO OPĚTOVNÉ POUŽITÍ MEMBRÁNY

Nylonové membrány mohou být použity 10-30x. Suchá membrána může být uskladněna při pokojové teplotě.

  • Vložte membránu do roztoku 0,2 M NaOH a za konstantního promíchávání inkubujte 10 min. Použijte cca 1-2 ml NaOH na každý 1cm2. Odstraňte NaOH.
  • Promyjte membránu 3x v 0,1 SSC/0,1% SDS/50 mM Tris-HCl (pH 7,5) po 5 min. Použijte cca 1-2 ml roztoku na každý 1cm2. Monitorujte pH promývacího roztoku pomocí pH papírku. Pokud roztok není neutrální, opakujte promývací kroky.

——————————————————————————————————————————————————————————————————————————————-

ALTERNATIVNÍ PREHYBRIDIZAČNÍ A HYBRIDIZAČNÍ ROZTOKY

Alternativně mohou být pro prehybridizaci a hybridizaci použity roztoky s přídavkem formamidu, který snižuje teplotu tání DNA. Tímto může být hybridizace prováděna při 42 °C.

 

Prehybridizační roztok s formamidem*

* skladováno ve  4 °C, délka skladovatelnosti max. 4 měsíce, před použitím přidejte denaturovanou DNA lososích spermií a temperujte na 65 °C

** do roztoku se přidává až před použitím. Před přidáním se DNA lososích spermií denaturuje zahřátím na 95 °C 5 min a poté prudkým zchlazením uložením na led na minimálně 1 minutu

 

Hybridizační roztok s formamidem*

* skladováno ve  4 °C, délka skladovatelnosti max. 4 měsíce, před použitím přidejte denaturovanou DNA lososích spermií a temperujte na 65 °C

** do roztoku se přidává až před použitím. Před přidáním se DNA lososích spermií denaturuje zahřátím na 95 °C 5 min a poté prudkým zchlazením uložením na led na minimálně 1 minutu

 

Příprava 1M fosfátu sodného (pH 6,7)

Rozpustíme 14,196 g Na2HPO4 v 80 ml purifikované vody. Upravíme pH na 6,7 pomocí kyseliny fosforečné a doplníme do 100 ml.