Tradiční klonování (subklonování)

Metoda tradičního klonování (tzv. subklonování)

Pro vložení cizí DNA (tzv. insertu) do plazmidu nejprve plasmid linearizujeme (tj. rozštěpíme jeho kruhovou molekulu). Pro linearizaci se používají restrikční endonukleázy, které štěpí v klonovacím místě vektoru (restrikční štěpení). Tzn., plasmid rozštěpíme v klonovacím místě některou z restrikčních endonukleáz. V závislosti na restriktáze, vzniklé konce mohou být buď tupé („blunt ends“) nebo kohesivní („sticky ends“).

labGuide tupe kohezivni konce

Konce takto linearizovaného plasmidu spojíme s konci vkládaného inzertu, a to pomocí enzymu T4 DNA ligázy (proces je označován jako ligace DNA). Spojované konce musejí být vzájemně kompatibilní, tzn., že v případě kohesivních konců musí být konce vektoru štěpené stejným restrikčním enzymem jako konce inzertu. Tupé konce se naproti tomu spojují s jakýmikoliv jinými tupými konci.

Tradicni klonovani

 Důležité zásady při tradičním klonování:

Pro štěpení vyberte pouze taková restrikční místa, aby ke štěpení došlo pouze v MCS, tedy ne v inzertu nebo v  sekvenci plasmidu mimo MCS!

Někdy je třeba dbát na správnou orientaci („levo-pravou“) vkládaného inzertu. Jedná se o případy, kdy např. zaklonováváte gen k promotoru již zaklonovaném v daném plasmidu nebo vytváříte fúzní gen.

Pokud vytváříte konstrukt pro fúzní protein, tedy spojujete dva geny dohromady, je třeba dbát na správný čtecí rámec u obou genů.

Vyhněte se štěpení s použitím pouze jednoho typu restriktázy a raději štěpení proveďte s dvěma restriktázami tak, aby výsledná molekula linearizovaného plasmidu po štěpení nesla nekompatibilní konce. Pokud je použit jen jeden typ restriktázy, při ligaci dochází preferenčně k recirkularizaci plasmidu, tj. ke vzájemnému spojování konců plasmidu, aniž by došlo k integraci inzertu. Pokud není zbytí a je třeba vektor štěpit pouze jednou restriktázou, je třeba takto rozštěpený vektor defosforylovat. Defosforylace zamezí recirkularizaci prázdného vektoru.

Pro účinnost ligace je výhodnější mít kohesivní konce, které se ligují účinněji než konce tupé.