TaqMan sondy

Real-time PCR

sipka vlevo

—————————————————————————————————————————-

TaqMan® sondy

TaqMan sondy jsou dvojitě barvené hydrolyzační sondy a jsou registrovanou značkou Roche Molecular Systems, Inc.

Využívají 5’ exonukleázové aktivity Taq polymerázy při syntéze DNA.

Jsou tvořeny 18-22 bp, která je komplementární k cílové sekvenci.

Na 5’ konci nesou reportérový fluorofor, na 3’ nesou molekulu zhášeče, tj. molekulu barviva, která blokuje emisi fluorescence z fluoroforu na 5’ konci (pokud je v dostatečné vzdálenosti).

Pokud sonda není činností Taq polymerázy hydrolyzovaná, zhášeč je v  blízkosti fluorochromu (jsou oba na molekule oligonukleotidu) a k fluorescenci nedochází.

Během PCR se sonda váže specificky mezi forward a reverse primery. Taq polymeráza, která během extense podle templátového řetězce syntetizuje DNA, narazí na přisedlou TaqMan sondu a svou exonukleázou aktivitou ji rozloží. Tím se separuje molekula fluorochromu od zhášeče a dochází k emisi fluorescence.

V průběhu PCR, při opakování jednotlivých cyklů, dochází k postupnému zvyšování fluorecenčního signálu.

Kritéria pro TaMan sondy:

Teplota tání (Tm): Teplota tání primerů by měla být 58-60°C a teplota tání TaqMan sondy by měla být o 6-8°C vyšší.

Délka primerů: Primery by měly být 15-30 bp dlouhé.

Obsah GC párů: Obsah GC párů by měl být 30-80%.

Délka amplikonu: Maximální délka amplikonu by neměla překročit 400 bp (ideálně 50-150 bp).

Taq man proby