Sekvenování nové generace

V posledních dvaceti letech vznikla řada metod označovaných jako „next generation sequencing“ neboli sekvenování nové generace, tj. metod, které v porovnání s klasickými metodami sekvenování umožňují především rychlou a cenově příznivou produkci velkého množství osekvenovaných vzorků najednou. Next generation sequencing využívá principu paralelizace procesu sekvenování, kdy dochází k sekvenování tisíců až milionů sekvencí současně. Výsledkem je obrovská produkce výstupních dat s následnou potřebou data utřídit a analyzovat.

Pro sekvenování nové generace v současné době existuje řada různých technologií, přičemž každá z technologií má své přednosti nebo naopak nevýhody a může být vhodná jen k určitým aplikacím. Nicméně pro všechny tyto metody existuje určité obecné schéma:

V prvním kroku je při těchto technikách templátová DNA fragmentovaná na úseky několika set bází dlouhé.

Konce získaných fragmentů jsou enzymatickou reakcí zatupeny a napojeny k oligonukleotidům určité sekvence (tzv. adaptéry).

Jednotlivé fragmenty jsou odděleně amplifikovány PCR reakcí (u některých technologií tento krok chybí) a pak v jednom kroku paralelně sekvenovány. Při tomto paralelním sekvenování se sekvenují milióny sekvencí najednou.

Délka získaných sekvencí je cca 20-700 bp. Sekvenační výtěžek jednoho běhu sekvenátoru může být až několik tisíc Gb, přičemž cena sekvenování za 1 b je až o dva řády nižší než by byla u kapilárního sekvenování Sangerovou metodou.

 

Využití:

Nové metody sekvenování jsou využívány především pro:

celogenomové sekvenování, tzn. de novo sekvenování neznámých genomů,

sekvenování jednotlivých chromosomů, plazmidů či mitochondrií,

studium genetické variability, mutační analýzu, kvantifikaci jednotlivých alel,

transkriptomovou analýzu (RNA-sequencing) – analýza exprese kódující i nekódující RNA v genomu,

studium DNA-proteinových interakcí (ChIP-sequencing),

metagenomiku (analýzu biologické diverzity) – např. pro genotypizaci baktérií.

 

Nejčastěji používanými platformami sekvenování nové generace jsou:

454 (Roche)

Solexa (Illumina)

Solid (Applied Biosystems)

Iont Torrent (Life Technologies)

PacBio (Pacific Biosciences)

Oxford Nanopore

 

Literatura:

Ansorge WJ (2009). Next-generation DNA sequencing techniques. N. Biotechnol. 25:195-203.

King, C; Scott-Horton, T. (2008). „Pyrosequencing: a simple method for accurate genotyping“. J Vis Exp (11).

Metzker J: (2010) Sequencing technologies – the next generation. Nat.Rev.Genet. 11: 31-46.

Mardis ER (2008) Next-generation DNA sequencing methods. Annu Rev Genomics Hum Genet 9: 387–402.

Pemov AH et al. (2005). DNA analysis with multiplex microarray-enhanced PCR. Nucleic Acids Res. 33:e11.

Tucker T, Marra M, Friedman JM (2009) Massively Parallel Sequencing: The Next Big Thing in Genetic Medicine. The American Journal of Human Genetics 85 (2): 142–154.

Stein RA (2008). Next-Generation Sequencing Update. Genetic Engineering & Biotechnology News 28 (15).

Williams R. et al. (2006). Amplification of complex gene libraries by emulsion PCR. Nature Methods 3, 545 – 550.

www.454.com