Scorpion sondy

Real-time PCR

sipka vlevo

—————————————————————————————————————————-

Scorpion sondy

Scorpion sonda je primer, který je komplementární k cílovému úseku a který na svém 5’ konci nese kovalentně navázanou fluorescenční sondu.

Fluorescenční sonda je oligonukleotid, který na jednom svém konci nese fluorochrom a na druhém svém konci nese molekulu, která funguje jako zhášeč, tj. blokuje fluorescenci fluorochromu.

Konce oligonukleotidu fluorescenční sondy jsou vzájemně komplementární, takže vytváří vlásenku, čímž se molekula fluorochromu a molekula zhášeče dostávají do blízké vzdálenosti a tím je blokovaná emise fluorescence z fluorochromu. Očko vlásenky samotné fluorescenční sondy je komplementární k cílové sekvenci.

Při PCR dochází prostřednictvím molekuly primeru k přisednutí Scorpion sondy k cílové sekvenci, poté k extenzi primeru a syntéze cílové sekvence. V dalším kole dochází o denaturaci k rozrušení vlásenky a přisednutí sekvence očka vlásenky k cílové sekvenci. Tím se dostávají molekuly fluorochromu a zhášeče od sebe a dochází k vyzařování fluorescence.

Kritéria pro Scorpion sondy:

Délka amplikonu: 100-200 bp.

Teplota tání: Teplota tání vlásenky by měla být 5-10C vyšší než teplota tání sondy.

Sekvence samotné fluorescenční sondy: Sekvence sondy je reverse komplement k cílové sekvenci.

Délka samotné fluorescenční sondy: Sekvence fluorescenční sondy by měla být 17-27 bp dlouhá. Cílová sekvence fluorescenční sondy by měla být vzdálena 11 bp nebo méně od 3’ konce Scorpion sondy.

Báze vlásenky: Báze vlásenky by měla být tvořen 6-7 bázemi, většinou z G a C, přičemž 5’ sekvence by měla začínat C míso G, protože G může zhášet FAM.

Scorpion sondy