Nukleázy

 Nukleázy jsou enzymy štěpící nukleové kyseliny rozkladem fosfodiesterové vazby. Nukleázy rozlišujeme na endonukleázy a exonukleázy.

Endonukleázy štěpí fosfodiesterové vazby uvnitř řetězce nukleové kyseliny. Naproti tomu exonukleázy štěpí nukleovou kyselinu od jejich konců, tak, že štěpením fosfodiesterové vazby postupně odštěpují jednotlivé nukleotidy. Dále rozlišujeme deoxyribonukleázy, které štěpí DNA, a ribonukleázy, které štěpí RNA.

 

 DNA polym DNA strukturanucleazy

 

  kohesivni a tupe konce

Kohesivní versus tupé konce

Při štěpení některými exonukleázami je rozhodující tvar konců. Tj., některé exonukleázy vyžadují pro svou aktivitu tupé konce či naopak konce s přesahy, tzv. kohesivní. Kohesivní versus tupé konce jsou také produktem štěpení příslušnými endonukleázami.

 

 

 

————————————————————————————————————————————————————————

DNáza I

Jedná se o endonukleázu, která štěpí jedno- a dvouřetězcovou DNA. Hydrolyzuje fosfodiesterové vazby, čímž vytváří mono- a oligodeoxyribonukleotidy s 5′-fosfátovou skupinou and 3′-OH skupinou. Aktivita enzymu je striktně závislá na přítomnosti Ca2+ a je aktivovaná ionty Mg2+ nebo Mn2+. V přítomnosti Mg2+, DNása I štěpí každý z řetězců dvouřetězcové molekuly DNA nezávisle.V přítomnosti   Mn2+, DNása I štěpí oba řetězcě dvouřetězcové molekuly DNA přibližně ve stejném místě, čímž vytváří fragmenty s tupými konci či převisy jednoho či dvou nukleotidů.

DNáza je vysoce citlivá na mechanické poškození. S roztokem DNázy zacházejte opatrně, nevortexujte, opatrně pipetujte. Promíchávejte opatrným otáčením zkumavky.

 

Nejčastější využití

Odstranění DNA ze vzorku RNA

Odstranění templátové DNA při in vitro transkripci

Značení DNA nick-translací ve spojení s DNA polymerázou I

Tvorba DNA knihoven produkcí náhodně překrývajících se fragmentů DNA (s využitím pufru obsahujícího Mn2+)

 

————————————————————————————————————————————————————————-

dsDNáza

Tento enzym štěpí fosfodiesterové vazby v DNA a produkuje oligonukleotidy s 5′-fosfátovou skupinou a 3′-hydroxylovou skupinou na jejich koncích. Je vysoce specifický k dvouřetězcové DNA, čímž je zajištěno, že RNA a jednořetězcová DNA přítomné ve vzorku nejsou štěpeny. Tato DNáza je velmi snadno ve vzorku inaktivována, a to zahřátím na 55°C.

 

Nejčastější využití

Odstraňování genomové DNA ze vzorku RNA

 

————————————————————————————————————————————————————————-

Endonukleáza IV (Endo IV)

Tato endonukleáza rozpoznává na DNA abazická místa a v těchto místech štěpí fosfodiesterovou vazbu. Enzym může v těchto místech rovněž fungovat jako 3′-diesteráza, takže je schopen produkovat 3’ fosfoglykolát a 3’ fosfát. Endo IV má také 3′->5′ exonukleázovou aktivitu.

 

Nejčastější využití

Analýza poškození DNA a aktivity opravných mechanismů

Comet assay

 

————————————————————————————————————————————————————————-

Endonukleáza V (EndoV)

Endonukleáza V je opravný enzym, který rozpoznává deoxyinosin, což je produkt deaminace deoxyadenosinu v DNA, a v menší míř také abazická místa, chybně spárované báze, vlásenky a smyčky.

 

Nejčastější využití

Při studiu mutageneze a DNA reparačních mechanismů

————————————————————————————————————————————————————————-

Exonukleáza I (ExoI)

Exonukleáza I rozkládá jednořetězcovou DNA, a to ve směru 3′->5′. Produkuje deoxyribonukleosid 5’-monofosfáty a na 5’konci zanechává dinukleotidy.

 

Nejčastější využití

Odstranění primerů po PCR reakci

  Enzym není vhodný pro odstraňování 3’ převisů u dvouřetězcové DNA

 

————————————————————————————————————————————————————————-

Exonukleáza III (ExoIII)

Exonukleáza III degraduje dvouřetězcovou DNA s tupých konců, 5’ převisů nebo jednořetězcových štěpů, přičemž uvolňuje 5′-mononukleotidy z 3′ konců DNA a produkuje úseky jednořetězcové DNA. Není aktivivní na 3’ převisech, které jsou alespoň čtyři báze dlouhé.Enzym rovněž vykazuje aktivitu RNázy H, 3´-phosphatázy and AP-endonucleázy.

 

Nejčastější využití

Produkce jednořetězcových fragmentů DNA

 

————————————————————————————————————————————————————————–

Lambda (λ) exonukleáza

Lambda Exonukleáza je aktivní na dvouřetězcové DNA ve směru 5′->3′, kdy odštěpuje 5’ mononukleotidy. Selektivně štěpí 5’ fosforylovaný konec dvouřetězcové molekuly DNA. Enzym rovněž vykazuje nízkou aktivitu na jednořetězcové DNA a na nefosforylované DNA. Je neaktivní na jednořetězcových štěpech nebo mezerách.

 

Nejčastější využití

Produkce jednořetězcové DNA, např. jednořetězcové DNA z PCR produktů

 

————————————————————————————————————————————————————————-

Mikrokokální nukleáza (S7 nukleáza)

Je relativně nespecifická endo-exonukleáza, která štěpí jedno- a dvouřetězcovou DNA a RNA, nicméně více je aktivní na jednořetězcových substrátech, rovněž štěpí preferenčně na AT či AU bohatých oblastech. Aktivita enzymu je striktně závislá na přítomnosti Ca2+.

 

Nejčastější využití

Sekvenování RNA

Analýza struktury chromatinu

 

————————————————————————————————————————————————————————-

RNáza A

RNáza A je endoribonukleáza, která specificky štěpí jednořetězcovou RNA na cytosinu a uracilu. Štěpí fosfodiesterovou vazbu mezi 5’-ribosou nukleotidu a fosfátovou skupinou umístěnou na 3’ ribose sousedního pyrimidinu. Výsledkem je 2’,3’ cyklický fosfát, který je hydrolyzován na příslušný             3’ nukleosid fosfát. Enzym je aktivní při širokém rozsahu podmínek. Při nízkých koncentracích solí (0 až 100 mM NaCl), štěpí jedno- a dvouřetězcovou RNA a stejně tak RNA v RNA-DNA hybridech. Při vysokých koncentracích NaCl (> 0,3 M) RNáza A specificky štěpí jednořetězcovou RNA.

 

Nejčastější využití

Odstraňování RNA při izolaci genomové a plasmidové DNA a přípravě rekombinančních proteinů

Ribonuclease protection assay

 

————————————————————————————————————————————————————————-

RNáza H

RNáza H specificky štěpí RNA v RNA-DNA hybridech. Neštěpí jednořetězcovou a dvouřetězcovu DNA nebo RNA.

 

Nejčastější využití

Odstranění RNA z molekuly RNA/DNA po syntéze prvního vlákna cDNA

 

————————————————————————————————————————————————————————-

RNáza I

 

Je endoribonukleáza, která preferenčně hydrolyzuje jednořetězcovou RNA na nukleosidy 3’ monofosfáty. Může být inaktivovaná inkubací v 100 °C po dobu 30 minut.

 

Nejčastější využití

Odstranění RNA z roztoků DNA a po přípravě rekombinantních proteinů

Ribonuclease protection assay

 

————————————————————————————————————————————————————————-

S1 nukleáza

Tento enzym štěpí jednořetězcové nukleové kyseliny s produkcí 5′-fosforyl mono- nebo oligonukleotidů. Je 5x aktivnější na DNA než RNA. S1 nukleáza rovněž štěpí dvouřetězcovou DNA v jednořetězcových místech, jako jsou jednořetězcové štěpy nebo jednořetězcové mezery, smyčky nebo nezpárované báze. Enzym vykazuje 3′-fosfomonoesterázovou aktivitu. Při své vysoké koncentraci a nízké koncentraci solí způsobuje zlomy v dvouřetězcové DNA, RNA a DNA/RNA hybridech.

 

Nejčastější využití

Odstranění jednořetězcových převisů u DNA fragmentů

S1 trancript mapování

Tvorba delecí ve fragmentech DNA ve spolupráci s Exonukleázou III