DNA POLYMERÁZY

DNA polymerázy jsou enzymy, které zajišťují syntézu DNA. Rozlišujeme DNA-dependentní DNA polymerázy, které jako templát využívají DNA, a RNA-dependentní DNA polymerázy (tzv. reverzní transkriptázy), které využívají jako templát RNA.

Činnost DNA polymeráz lze charakterizovat takto:

Při své činnosti přisedají k jednořetězcovému úseku DNA či RNA, podle kterého tvoří nový řetězec, a který takto funguje jako tzv. templát. DNA polymerázy ke své činnosti templát obvykle vyžadují, nicméně jsou výjimky, které provádí syntézu bez templátu, např. se jedná o terminální deoxynukleotidyltransferázu.DNA polym DNA struktura

DNA polymeráza začíná syntézu od krátkého oligonukleotidu (tzv. primeru), který je díky komplementaritě přisedlý k templátovému řetězci.

 

DNA polymeráza přidá k 3’ konci tohoto primeru dle templátového řetězce příslušný deoxyribonukleotid (dNTP) a syntéza DNA se rozjíždí postupným přidáváním dalších dNTP. Jednotlivé dNTP jsou pospojovány prostřednictvím fosfodiesterových vazeb, které se vytváří mezi fosfátovou skupinou jednoho deoxyribonukleotidu a 3’ uhlíkem druhého deoxyribonukleotidu.

Díky tomuto mechanismu se syntetizovaný řetězec prodlužuje ve směru 5’→3′.

 

 

Exonukleotická aktivita DNA polymeráz

Některé DNA polymerázy mají exonukleotickou aktivitu, tzn. jsou schopny rozkládat řetězec DNA. Rozlišujeme 3’→5′ exonukleázovou („proofreading“) aktivitu a 5’→3′ exonukleázovou.

 

3’→5′ exonukleázová aktivita je nukleolytická aktivita proti směru syntézy, tzn. ve většině případů DNA polymeráza touto aktivitou rozkládá řetězec DNA, který sama nasyntetizovala. Proto se této aktivitě také říká „opravná“ (v angličtině „proofreading“).

 

Naopak 5’→3′ exonukleázová aktivita je směrovaná k řetězci DNA, který leží ve směru syntézy, tzn. DNA polymeráza tento řetězec nejprve rozloží a poté na jeho místě nasyntetizuje nový. 5’→3′ exonukleázové aktivity je využíváno např. při značení DNA, kdy do reakce dodáme značené nukleotidy, které jsou inkorporovány na místo původních.

 

 aktivita DNA polymeráz

 —————————————————————————————————————————–

 

DNA POLYMERÁZA I

Jedná se o templát-dependentní DNA polymerázu, která katalyzuje reakci ve směru 5’→3′. Vykazuje rovněž 3’→5′ exonukleázovou („proofreading“) aktivitu a exonukleázovou aktivitu ve směru 5’→3′.

 

Nejčastější využití

Značení DNA nick-translací (inkorporace značených nukleotidů např. biotinem, digoxigeninem, atd)

Syntéza druhého řetězce cDNA v kombinaci s RNázou H

 

 

——————————————————————————————————————————

KLENOWŮV FRAGMENT

Klenowův fragment je fragment DNA polymerázy vykazující 5’→3′ polymerázovou aktivitu a 3’→5′ exonukleásovou (proofreading) aktivitu, ale postrádající 5’→3′ exonukleásovou aktivitu.

 

 

Nejčastější využití

Vytvoření tupých konců doplněním 5’ převisů

Značení DNA metodou Random-primed DNA labeling (inkorporace značných nukleotidů Cy3-, Cy5, biotinem, digoxigeninem a fluorescenčně značené nukleotidy)

Značení konců DNA doplněním 5’ převisů

Sekvenování DNA Sangerovou metodou

Syntéza druhého vlákna cDNA

 

 

——————————————————————————————————————————

T4 DNA POLYMERÁZA

Je templát dependentní DNA polymeráza, která katalyzuje 5′->3′ syntézu. Má 3′->5′ exonukleázovou aktivitu, ale postrádá 5′->3′ exonukleázovou aktivitu.

 

Nejčastější využití

Vytvoření tupých konců zaplněním 5’ převisů nebo odstraněním 3’ převisů

Značení 5’ a 3’ konců DNA

In vitro mutageneze

 

—————————————————————————————————————————–

T7 DNA POLYMERÁZA

Je templát dependentní DNA polymeráza, která katalyzuje syntézu DNA ve směru 5’->3’. Je vysoce procesivní a umožňuje syntézu dlouhých úseků DNA. Vykazuje také vysokou 3′->5′ exonukleázovou aktivitu vzhledem k jednořetězcové a dvouřetězcové DNA. 3′->5′ exonukleázová aktivita je asi 1000x silnější než stejná aktivita u Klenowova fragmentu.

 

Nejčastější využití

Reakce „primer extension“ na dlouhých templátech

Značení 3’ konců DNA

Vytvoření tupých konců zaplněním 5’ převisů

Syntéza druhého vlákna cDNA

 

——————————————————————————————————————————

TERMINÁLNÍ DEOXYNUKLEOTIDYLTRANSFERÁZA (TdT)

Jedná se o beztemplátovou DNA polymerázu, která katalyzuje opakované přidávání deoxyribonukleotidů k 3’- OH oligodeoxyribonukletidů a jedno- a dvouřetězcové DNA.

 

Nejčastější využití

Produkce syntetických homo- a heteropolymerů

Značení 3’ konců DNA značenými nukleotidy

5′-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)