Protilátky

Protilátky (imunoglobuliny) jsou glykoproteiny, které fungují v rámci imunitního systému organismu za cílem nalézt a odstranit cizorodé makromolekulární agens. Cizorodé molekuly, které jsou protilátkami rozpoznávané, jsou označované jako antigeny. Antigeny jsou zpravidla molekuly bílkovin, ale také např. cukrů o vyšší molekulové hmotnosti. Protilátky jsou syntetizovány určitou skupinou bílých krvinek, tzv. B-lymfocyty.

B-LYMFOCYTY

B-lymfocyt má protilátku vázanou na svém povrchu jako tzv. antigenní receptor, který vyhledává a navazuje určitý antigen. Při vazbě protilátky s antigenem, příslušný B-lymfocyt je stimulován k množení (proliferaci) a také k tvorbě a vylučování dané protilátky do oběhu. Tímto způsobem dochází ke zvýšení množství daných protilátek v krvi. Vzniklé protilátky se naváží na svůj antigen, dochází k tvorbě agregátů antigenů s protilátkami, čímž je umožněno odstranění cizorodé látky (např. pohlcením celého komlexu fagocytozou). B lymfocyty jsou nositeli humorální imunity.

Po stimulaci antigenem, kdy dochází k proliferaci daných B lymfocytů, vznikají efektorové a paměťové buňky. Efektorové buňky jsou plazmatické buňky, které ve velkém množství syntetizují a do prostředí uvolňují dané protilátky. Paměťové buňky zase nesou imunologickou paměť a mají schopnost produkovat další efektorové a paměťové buňky, pokud jsou stimulovány odpovídajícím antigenem. Zatímco efektorové buňky existují v organismu jen několik dní, paměťové buňky žijí desítky dní.

B-lymfocyty vznikají v kostní dřeni (jakožto v primárním lymfoidním centru). Stimulace lymfocytů k odpovědi probíhá v sekundárních lymfoidních orgánech (např. uzliny, mandle, slezina), jimiž cirkulují antigeny sbírané lymfatickým oběhem nebo v případě sleziny antigeny sesbírané krví. Antigeny jsou zde vychytávány buňkami APC (antigen presenting cell) a předkládány lymfocytům. Při styku s příslušným antigenem dochází k aktivaci, dělení a diferenciaci lymfocytů.

Protilatky

MOLEKULA IMUNOGLOBULINU

Molekula imunoglobulinu je tvořena jednotkou ve tvaru písmene Y, složené ze čtyř polypeptidických řetězců, a to ze dvou identických, krátkých, tzv. lehkých řetězců a dvou identických, dlouhých, tzv. těžkých řetězců (označeno dle jejich reimunoglobulinlativní molekulové hmotnosti). Oba typy řetězců jsou tvořeny variabilní a konstantní částí. Variabilní části, tj části, které se mezi jednotlivými protilátkami liší složením aminokyselin, se nachází na vrcholu “Y”, tzn. na aminových koncích řetězců. Variabilní části protilátky jsou zodpovědny za vazbu k antigenu. Díky variabilitě těchto oblastí existují různé varianty protilátek. Oblast řetězce na karboxylovém konci je neměnná a proto se nazývá oblast konstantní. Řetězce jsou spojeny disulfidovými můstky umožňujícími pohyblivost.

 

Lehké řetězce jsou odlišovány na typ kappa (κ) a lambda (λ). Existuje pět typů savčích imunoglobulinových těžkých řetězců označovaných jako α, δ, ε, γ, and μ. Podle typu těžkého řetězce rozdělujeme protilátky na pět tříd, tzv. izotypů: IgA, IgG, IgD, IgE, a IgM. Rozdílné typy těžkých řetězců se liší ve velikosti a složení: α a γ obsahují asi 450 aminokyselin, zatímco μ a ε mají cca 550 aminokyselin.Konstantní oblasti těžkých řetězců jsou identické u všech protilátek stejného izotypu, ale liší se u protilátek různých izotypů. Těžké řetězce γ, α a δ mají konstantní oblast tvořenou ze tří tandémových domén, těžké řetězce μ a ε mají konstantní oblast tvořenou ze čtyř imunoglobulinových domén. Variabilní oblast těžkého řetězce se liší u protilátek produkovaných různými B lymfocyty, ale jsou stejné u protilátek produkovaných jednotlivým B lymfocytem nebo klonem jednoho B lymfocytu.

Molekulu protilátky lze rozdělit na:

  • Fab-fragment, to jest dvě části obsahující rozvětvená ramena (celý lehký a část těžkého řetězce),
  • Fc-fragment, to jest zbývající část těžkých řetězců.

Jednotlivé třídy a podtřídy protilátek:
         Třídy: IgG, IgM, IgA, IgE, IgD
         Podtřídy lidských imunoglobulinů: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, and IgA2
         Podtřídy myších imunoglobulinů: IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3
         Lehké řetězce: Kappa, Lambda
         Těžké řetězce: IgG (gama), IgM (mu), IgA (alfa), IgD (delta), IgE (epsilon)

 

INTERAKCE PROTILÁTKY S ANTIGENEM

Interakce protilátky s antigenem je základem všech laboratorních imunochemických metod. Oblast protilátky, která reaguje s antigenem, je označovaná jako paratop. Oblast antigenu, která reaguje s protilátkou je zase označovaná jako epitop neboli antigenní determinant.

Mezi vazebnými místy protilátky a determinantními skupinami antigenu vzniká biospecifická vazba a vznikají protilátkově-antigenní komplexy, tzv. imunokomplexy. Intenzita interakce mezi protilátkou a antigenem je vyjádřena afinitou protilátky. Celková stabilita komplexu protilátky a antigenu je vyjádřená aviditou.

Počet vazebných míst na molekule protilátky, která jsou schopna interagovat s determinantami určitého antigenu, je vyjádřen valencí protilátky. Naopak, počet determinantních skupin antigenu, které se mohou vázat s protilátkou je vyjádřen valencí antigenu.

Vazebné místo protilátky je vytvářeno variabilními doménami lehkého a těžkého řetězce. Počet vazebných míst se liší podle třídy imunoglobulinu:IgG má dvě vazebná místa,IgA  čtyři a IgM teoreticky deset, ale prakticky asi jen pět.

 

 

Ačkoliv platí, že každý antigen je rozpoznáván a navazován příslyšným lymfocytem a příslušnou protilátkou, ne každý antigen může vyvolat imunitní reakci. Antigeny, které vedou k imunitní reakci, tzn. vyvolávají a stimulují tvorbu protilátek, označujeme jako imunogeny. Imunogeny jsou obvykle vysoko molekulární látky a obvykle jimi bývají proteiny nebo polysacharidy. Antigeny, které nevedou k imunologické reakci, ačkoliv jsou rozpoznány příslušnou protilátkou, označujeme jako hapteny. V případě haptenů lze imunologickou reakci vyvolat až po navázání haptenu na makromolekulární molekulu – nosič (např. bovinní sérum albumin), kdy vzniká konjugát, který je imunogenní. Antigenní determinanta hapténu je pak jednou z determinant na struktuře. Jako hapteny mohou fungovat nejrůznější malé molekuly jako např. jednoduché cukry, aminokyseliny, malé peptidy, nukleové kyseliny. Imunitní systém může tvorbou specifických protilátek reagovat na přítomnnost jakékoliv cizorodé molekuly. Nicméně specifická imunitní odezva může být značně variabilní a závisí na velikosti, struktuře a skladbě antigenu. Antigeny, které evokují silnou imunitní odezvu, jsou označovány jako silně imunogenní.

 

POLYKLONÁLNÍ X MONOKLONÁLNÍ PROTILÁTKY

Produkce polyklonálních protilátek je prováděná imunizací s určitým antigenem opakovaně po několik týdnů, což stimuluje specifické B-lymfocyty k produkci obrovského množství daných protilátek. Protože je tímto způsobem stimulováno velké množství různých lymfocytů, vzniká tak velké množství různých klonů daných B lymfocytů. Jednotlivé klony pak produkují protilátky, které se navzájem mírně odlišují ve způsobu vazby k danému antigenu.Polyklonální protilátky jsou takto vlastně směsi protilátek.

Monoklonální protilátky jsou produkcí jednoho klonu B lymfocytů. Proto jsou monoklonální protilátky na rozdíl od polyklonálních zcela homogenní, s jasně definovanou specificitou. Pro produkci monoklonálních protilátek jsou využívány nádorové formy plasmatických buněk, tzv. myelomové buňky. Tyto buňky se jako každé jiné nádorové buňky rychle množí, mají velkou odolnost a životnost a jsou takto vhodné pro in vitro kultivaci. Pro přípravu monoklonálních protilátek se myelomové buňky zfúzují s vybraným klonem B-lymfocytů. Touto fúzí vzniká hybridní buňka (tzv. hybridom), která jednak produkuje požadovanou protilátku a jednak se rychle množí a je nesmrtelná. Protilátka je vylučovaná hybridní buňkou do média v kultuře. Médium s protilátkou lze pro následné metody využít jako takové, případně protilátka může být z média izolovaná afinitní purifikací.

 

Polyklonální protilátky

Sérum obsahuje heterogenní směs protilátek různé afinity

Rozpoznávají různé epitopy na jednom antigenu.

Především jsou tvořeny třídou IgG

Produkce protilátek je poměrně nenáročná a levná

  Výhody polyklonálních protilátek:

Protože polyklonální protilátky rozpoznávají na jednom antigenu různé epitopy, mohou zesilovat signál cílového proteinu s nízkou expresní hladinou. Protein totiž může vázat víc než jednu protilátku na svých různých epitopech.

Polyklonální protilátky dávají lepší výsledky při IP nebo ChiP.

Tolerantní k malým změnám ve struktuře antigenu, např. polymorfismus, heterogeneita glykosylace, mírná denaturace, v porovnání s monoklonálními protilátkami.

Využívají se k identifikaci proteinů s vysokou homologií k imunogennímu proteinu nebo detekci cílového. proteinu ve vzorcích z jiných druhů, než ve kterých byl imunogen připraven.

Jsou využívány pro detekci denaturovaných proteinů.

Umožňují robustní detekci.

Nejsou použitelné pro testování přítomnosti specifické domény antigenu.

   Nevýhody polyklonálních protilátek:

Variabilita protilátky v různých várkách.

Pro velké množství nespecivických protilátek mohou vést k vyššímu nespecifickému pozadí.

S vyšší pravděpodobností vedou ke křížové reaktivitě.

 

Monoklonální protilátky

Detekují na antigenu pouze jeden epitop.

Náročná příprava protilátek.

Všechny várky dávají naprosto identické protilátky.

   Výhody monoklonálních protilátek:

S nižší pravděpodobností vedou ke  křížové reaktivitě.

Dávají poměrně nízké nespecifické pozadí.

Umožňují vysokou reproducibilitu experimentů.

Pro svou specificitu jsou využívány k selekci antigenu ze směsi podobných proteinů při afinitní purifikaci.

   Nevýhody monoklonálních protilátek:

Mohou být příliš specifické a tím použitelné pouze u daného druhu organismu.

Ve srovnání s polyklonálními protilátkami jsou více náchylné k nerozpoznání antigenu díky např. jeho chemickým změnám.

 

DOSTUPNÉ FORMY PROTILÁTEK

Protilátky jsou při jejich přípravě získávány ze séra neboli antiséra, ascitické tekutiny nebo supernatantu tkáňových kultur. Mohou být využity v nepurifikované formě nebo před použitím mohou být purifikovány.

ANTISÉRUM. Antisérum je získáno z krve imunizovaného organismu, která je zbavená koagulačních proteinů a červených krvinek. Antisérum tak obsahuje protilátky všech typů a stejně tak proteiny séra. Kromě protilátek proti cílovému antigenu jsou v séru přítomny protilátky proti jiným antigenům, které pak v imunologických esejích mohou vést k nespecifickým signálům. Z tohoto důvodu je sérum purifikováno, a to tak, že jsou odstraněny proteiny séra a zvýší se zastoupení specifických protilátek.

ASCITICKÁ TEKUTINA. Monoklonální protilátky mohou být produkovány pěstováním hybridomů v peritoneální dutině myši či potkana. Po injikaci hybridomů do peritoneální dutiny, se zde hybridomy začnou množit a produkovat tekutinu, která obsahuje vysoké množství protilátky.

V antiséru, ascitické tekutině či supernatantu tkáňové kultury se koncentrace nepurifikovaných látek mohu významně lišit. Nicméně pro každou imunochemickou metodu existuje obecně doporučené množství protilátky (viz. tabulka). Skutečně optimální množství protilátky je ovšem často nutné zjistit empiricky.

 

PURIFIKACE PROTILÁTEK

Purifikace protilátek, ať už polyklonálních z antiséra nebo monoklonálních z ascitické tekutiny nebo supernatantu tkáňové kultury, se provádí dvěma metodami:

Proteinová A/G purifikace
Tento způsob purifikace využívá protein A (z baktérie Staphylococcus aureus) nebo protein G (z baktérií Streptococcus), které vykazují silnou afinitu k Fc oblasti protilátek. Využitím proteinové A/G purifikace při purifikaci polyklonálních protilátek ze séra dochází k odstranění proteinů séra, nicméně nespecifické imunoglobulinové frakce zůstávají zachovány. Protilátky purifikované z antiséra tak stále mohou vykazovat nežádoucí křížovou reaktivitu.

Afinitní purifikace

Afinitní purifikace isoluje specifické proteiny na základě reversibilní interakce mezi proteiny a specifickým ligandem navázaným na chromatografickou matrix. Je přitom využívaná afinita specifického imunoglobulinu vůči antigenu, proti kterému byla vyvinuta. Tato metoda purifikace vede k odstranění nespecifickým imunoglobulinových frakcí.

 

 

VÝBĚR VHODNÉ PROTILÁTKY

Pro dostatečnou interakci mezi antigenem a protilátkou je třeba, aby epitop antigenu byl dostatečně čitelný a k vazbě dostatečně přístupný. Pokud je např. cílová molekula denaturovaná (např. díky nevhodné fixaci, změnám v pH nebo přípravou pro elektroforézu), může to ovlivnit schopnost interakce s protilátkou. V praxi to znamená, že některé protilátky nejsou efektivní při western blotu, kdy se přípravou vzorku změní konformace proteinu a tím se pozmění struktura epitopu, ale přitom může platit, že stejná protilátka je velmi vhodná pro imunohistochemické metody na tkáních, kdy struktura epitopu je zachovaná. Takže např. může být, že epitop je dostupný, jen pokud je antigen ve své přirozené formě, nebo naopak je k protilátce dostupný, jen pokud je antigen denaturován a tím je epitom odryt a je tak přístupný protilátce.

Při výběru vhodné protilátky je třeba brát zřetel na tyto hlediska:

Charakter vzorku, tj., aby protilátka rozpoznávala např. cílovou isoformu proteinu, cílovou doménu proteinu, apod.

Příprava vzorku. Některé protilátky vyžadují, aby byl vzorek připravován jen určitým způsobem. U některých protilátek je třeba, aby byl vzorek denaturován, protože denaturací dojde k obnažení epitopů, které by jinak zůstaly skryty pod sekundární či terciální strukturou proteinu. Naopak existují protilátky, které vyžadují protein v nativní formě a protein nerozeznají, pokud byl připraven v roztoku obsahujícím některý z detergentů (SDS, deoxycholát). Tyto protilátky totiž rozeznávají své epitopy v závislosti na sekvencích aminokyselin, které se na základě troj-rozměrné struktury proteinu nacházejí v blízkosti epitopu. U protilátek za účelem imunohistochemie by měl být brán zřetel na to, že některé protilátky např. fungují pouze v nefixovaných, zmražených tkáních, jiné zase nefungují v tkáních fixovaných formaldehydem, apod. Experimentální omezení protilátek jsou vždy uváděna v manuálu od výrobce.

Druh testovaného organismu. V manuálu od výrobce je k dané protilátce uveden seznam organismů, u kterých protilátka reaguje. Pokud v seznamu testovaný organismus uveden není, neznamená to nutně, že protilátka v tomto organismu nereaguje, ale spíš, že u tohoto organismu protilátka testovaná nebyla. Křížová reaktivita může být odhadnuta na základě sekvenční podobnosti proteinů.V experimentech, kde se kromě primární protilátky používá sekundární protilátka, konjugovaná s nějakou detekční molekulou (enzym, fluorochrom, biotin, atd), je třeba, aby primární protilátka pocházela z hostitelského organismu nepříbuzného k testovanému organismu. Tím je zamezena možná křížová reaktivita sekundární protilátky s endogenními imunoglobuliny vzorku. Takže např., primární protilátka, která má být použita v myši, nemůže být připravena v myši či potkanu, ale třeba v králíku (rabbit). Proti této primární protilátce je pak použita anti-rabbit IgG sekundární protilátka, která je konjugovaná s příslušnou detekční molekulou. Pro tento případ lze také alternativně využít konjugovanu primární protilátku. Tzn., můžeme použít primární protilátku, která byla připravena ve stejném druhu hostitelského organismu jako je testovaný organismus, ale která je konjugovaná s detekční molekulou.

 

KONCENTRACE PROTILÁTKY PŘI EXPERIMENTECH

Síla vazby mezi protilátkou a antigenem je ovlivněna vzájemnou koncentrací protilátky a antigenu, ale také teplotou, pH a složením pufru. Pro sílu vazby je ovšem také důležitá vzájemná koncentrace protilátky a antigenu. Je to ale především koncentrace antigenu, kterou dopředu nelze přesně zjistit a nelze ji také ovlivnit. Pro daný experiment je proto třeba stanovit optimální koncentraci protilátky. Ke každé protilátce získané od výrobce existují k jednotlivým aplikacím určitá obecná doporučení vhodného ředění. Skutečně optimální koncentraci protilátky k danému experimentu je ovšem třeba odvodit experimentálně, a to pomocí ředící řady dané protilátky.

Optimální koncentrace protilátky v experimentu je taková koncentrace, která vede k nejcitlivější detekci, ovšem s minimem nespecifického vázání. Při testování nové protilátky pro danou aplikaci v laboratoři, je protilátku třeba otestovat a titračním experimentem zjistit její optimální koncentraci. Takže např., pokud manuál od výrobce doporučuje ředění 1:200, lze protilátku testovat ředící řadou 1:50, 1:100, 1:200, 1:400 a 1:500. Nejlepší výsledek z ředící řady nám přiblíží optimální koncentraci protilátky. Obdobně, je rovněž třeba brát zřetel na to, že u antisér polyklonálních protilátek může být koncentrace dané protilátky odlišná i mezi různými várkami (baleními) protilátky. Pokud je tedy zakoupeno nové balení takovéto protilátky, je třeba toto vést v patrnosti a v případě pochybností provést opět titrační experiment.

Obecná doporučení k ředění protilátek při jednotlivých aplikacích jsou uvedená v následující tabulce:

protilatky tabulka2

 

SEKUNDÁRNÍ PROTILÁTKY

Sekundární protilátky slouží k detekci, třídění nebo purifikaci cílových antigenů, a to svou vazbou k primární protilátce, která je navázaná k antigenu. Sekundární protilátka může být označena navázaným enzymem, fluorochromem či jinou molekulou.

Sekundární protilátka je produkovaná imunizací pomocí dané primární protilátky. Imunizace je přitom prováděna v jiném druhu hostitelského organismu, než byl hostitelský organismus primární protilátky. Takže, např., pokud je primární protilátka připravena v myši (mouse), jako sekundární protilátka je pro experimenty používaná protilátka anti-mouse, s tím, že tato sekundární protilátka byla připravena v králíku nebo koze či jiném organismu, kterému byla injikovaná primární protilátka. 

Např., pokud imunizujeme kozu (goat) s purifikovanou mouse (myší) IgG, získáme goat anti-mouse IgG, která se bude vázat ke všem třídám, těžkým a lehkým řetězcům, a fragmentům myší IgG, stejně tak jako k další molekulám, které vykazují sekvenční homologii. Naopak, pokud imunizujeme kozu s mouse IgG1, vytvoří se protilátky specifické pouze k mouse IgG1 a molekulám, které vykazují stejnou homologii. Vzhledem k vysokému stupni homologie, jsou protilátky dále pomocí afinitní purifikace přečišťovány, a to tak, aby nevykazovaly křížovou reaktivitu s jinými imunoglobuliny.

 

 Výběr sekundární protilátky dle primární protilátky

 Sekundární protilátka by měla odpovídat třídě nebo podtřídě primární protilátky. Polyklonální protilátky jsou typicky IgG a sekundární protilátky k těmto primárním protilátkám jsou anti-IgG. Monoklonální protilátky jsou ve většině případů vyvinuty v myších, občas i v potkanech, křečcích či králících. Pokud primární protilátka je myší IgM, měla by být použita anti-mouse IgM, ale případně také může být použita anti-mouse IgG.

Pokud primární monoklonální protilátka je jednou z podtříd IgG (IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgG3), může být použita jakákoliv anti-mouse IgG. Pokud není známa subtřída primární protilátky, může být použita anti-mouse IgG, a to proto, že rozpoznává většinů myších IgG subtypů. 

Polyklonální protilátka jsou typicky IgG, takže proti nim mohou být použity sekundární protilátky anti-IgG.

Celý IgG nebo fragment  F(ab‘)2 jako sekundární protilátka?

Pro experimenty s tkáněmi nebo buňkami s Fc receptory (např. brzlík, slezina, krev, leukocyty) je lépe jako sekundární protilátku zvolit F(ab‘)2, a to proto, aby bylo eliminováno nespecifické vázání k Fc receptorům přítomným na buňkách. Alternativně vazba k Fc receptorům může být blokovaná inkubací s purifikovaným IgG nebo sérem hostitelského organismu sekundární protilátky.

 

Reaktivita sekundárních protilátek může být charakterizovaná jako: 

  • Polyvalentní: reaguje se všemi třídami primárních protilátek
  • Specifická pro Anti-Fc a těžký řetězec: reaguje pouze s těžkými řetězci, proto je specifická k dané třídě primární protilátky
  • Specifická pro Anti-Fab a celou molekulu: reaguje s těžkými i lehkými řetězci. Vzhledem k reaktivitě s lehkými řetězci, reaguje se všemi třídami protilátek.
  • Specifická pro lehký řetězec (kappa, lambda): reaguje se všemi třídami primárních protilátek, a to proto, že všechny třídy využívají stejný kappa nebo lambda řetězec.

Sekundární protilátky mohou být dostupné v několika formátech:
Celé IgG:jsou nejčastějším typem sekundárních protilátek vhodným pro většinu aplikací.

F(ab‘)2 fragmenty: Vznikají odstraněním Fc části z protilátky, což vede ke snížení velikosti protilátky, zabránění křížové reaktivity s hostitelskými Fc oblastmi. Fc oblasti jsou odstraňovány štěpením IgG pomocí pepsinu, čímž zůstává divalentní F(ab‘)2 fragment (~100 kDa) protilátky.

Fab fragmenty: Fab fragmenty vznikají enzymatickým štěpením pomocí papainu, který štěpí protilátku mezi antigen vazebnou doménou a pantovou oblastí, takže se tvoří dva Fab fragmenty a Fc fragment. Malá velikost Fab fragmentu (~50 kDa) může zvýšit detekci antigenu tím, že protilátka penetruje snáze do hlubších oblastí antigenu. Fab fragmenty jsou užitečné pro vyhledávání malých intracelulárních antigenů, které díky své velikosti mohou procházet membránami buněk. Odstraněním Fc oblasti zabraňuje křížové reaktivitě s hostitelskými Fc oblastmi.

Značení sekundárních protilátek

 Sekundární protilátky jsou značeny enzymy (peroxidásou, alkalickou fosfatázou) fluorochromem nebo jsou konjugovány s biotinem. Pro imunoblotovací techniky a metodu ELISA jsou nejčastěji využívány sekundární protilátky značené enzymy jako je peroxidáza nebo alkalická fosfatáza. Peroxidáza ve srovnání s alkalickou fosfatázou je levnější a stabilnější, naopak alkalická fosfatáza je v porovnání s peroxidázou citlivější, a to zvlášť pokud je využívaná kolorimetrická detekce. Využití fluorochromů je výhodné, pokud je třeba dvojitého či vícenásobného značení. Protilátky konjugované s biotinem jsou vhodné pro amplifikaci signálu a tím vyšší senzitivitu než jaká je dosahovaná s použitím enzymů či fluorescence.

 

Literatura:

Sompayrac L. How the Immune system works. 4. vydání. Wiley-BlackWell, 2012. ISBN-10: 0470657294

Hořejší, V. &  Bartůňková J, et al. Základy imunologie4. vydání. Praha. Triton, 2009.  ISBN 978-80-7387-280-9.

www.abcam.com

www.sigma.com