Problémy při hybridizaci

Hybridizační techniky

sipka vlevo

——————————————————————————————————————————–

ŘEŠENÍ PROBLÉMŮ PŘI HYBRIDIZACI

Problémy při hybridizaci se týkají především buď vysokého pozadí, tj. přítomnosti silného nespecifického signálu, nebo naopak příliš nízkého specifického signálu.

Při hybridizačních technikách bychom měli dbát na několik zásad:

Všechny roztoky při hybridizačních technikách by měly být připraveny z purifikované vody a mělo by být používáno čisté nádobí. Zvláště voda znečištěná organickým obsahem může způsobovat vysoké pozadí.

S membránou by mělo být zacházeno opatrně, v rukavicích a manipulovat s ní pokud možno s pinzetami.

Teplota při hybridizaci a při promývacích krocích by měla být precizně kontrolovaná, používané roztoky by měly být předem vytemperovány na požadovanou teplotu.

Při přenosu na membránu  by měly být odstraněny veškeré bubliny, které se mohou zformovat pod či nad membránou.

Při radioaktivním značení lze při posledním promývacím kroku míru pozadí monitorovat Geigerovým počítačem. Pokud je v místech na membráně, kde není očekáván specifický radioaktivní signál, zaznamenána vysoká míra radioaktivity, svědčí to o vysoké míře pozadí. V tom případě je možno pokračovat v dalších promývacích krocích.

VYSOKÉ NESPECIFICKÉ POZADÍ

Nejčastější důvody:

Roztoky nebyly předem vytemperovány

Vysoká koncentrace sondy

Sonda nebyla přečištěna od neinkorporovaných nukleotidů po značení

Nedostatečná prehybridizace

Hybridizační či promývací podmínky nejsou dostatečně stringentní

Zaschnutí hybridizačních či promývacích roztoků na membráně

Zbytky agarosy na membráně – membrána by měla být dostatečně opláchnuta v 2X SSC před fixací

 

Nejčastější řešení:

Příliš nízká teplota – zvyšte teplotu při hybridizaci a promývacích krocích

Příliš vysoká koncentrace solí – snižte koncentraci solí při promývacích krocích

Zvyšte koncentraci SDS

Prodlužte dobu promývání

 

NEDOSTATEČNÝ HYBRIDIZAČNÍ SIGNÁL

Nejčastější důvody:

Nedostatečná detekce

Nedostatečný transfer na membránu

Nízká koncentrace DNA/RNA na membráně

Nedostatečná koncentrace sondy

Nízká nebo chybějící homologie mezi sondou a cílovým úsekem

Dvouřetězcová sonda nebyla dostatečně denaturovaná

Sonda byla špatně naznačená

Doba hybridizace byla krátká

Hybridizační či promývací podmínky jsou příliš stringentní

 

Nejčastější řešení:

Zvýšení množství vzorku

Zvýšení koncentrace sondy nebo zahrnutí 10% dextran sulfátu

Snížení teploty při hybridizaci a promývacích krocích

Zvýšení koncentrace solí při promývacích krocích

Prodloužení doby promývání

Snížení koncentrace SDS

Zkrácení doby promývání

Optimalizace značení sondy či transferu na membránu