Oligo klonování

OLIGO KLONOVÁNÍ

Oligo klonování slouží k inzerci krátkých oligonukleotidů do stávajících vektorů. Pokud máme nějaký náš oblíbený vektor, který ovšem nenese dostatečná restrikční místa, můžeme MCS tohoto vektoru obohatit o nová restrikční místa právě oligo klonováním.

Princip metody tkví v tom, že si necháme některou z dostupných firem vyrobit dva k sobě komplementární oligonukleotidy, které nesou potřebná restrikční místa.

Oligonukleotidy ovšem musí na svých koncích obsahovat ještě krátkou dodatečnou sekvenci, která po vzájemné hybridizaci oligonukleotidů poskytne jednořetězcové převisy.

Jednořetězcové převisy musí být komplementární ke koncům cílového vektoru (vzniklých štěpením příslušnou restriktázou) a umožní tak integraci oligonukleotidu do tohoto vektoru.

 

 Oligo klonování

 

 Obr. Pro oligo klonování si necháme vyrobit krátké oligonukleotidy (1), které po vzájemné hybridizaci vytváří dvouřetězcovou molekulu s jednořetězcovými převisy na svých koncích (2). Jednořetězcové převisy fungují jako komplementární sekvence s konci vektoru. Vektor je naštěpen danými restrikčními enzymy (3) a je spojen s připraveným dvouřetězcovým oligonukleotidem (4).

 

Postup při oligo klonování

1. Navrhněte oligonukleotidy a nechte je vyrobit v některé z komerčních společností

2. Dodané oligonukleotidy resuspendujte v hybridizačním pufru (10mM Tris, pH7.5-8.0, 50mM NaCL, 1m EDTA) a smíchejte v ekvimolární koncentraci, nejlépe 2 μg z každého oligonukleotidu v 50 μl objemu.

3. Směs zahřejte na 90-95 oC po dobu 5 min, poté 45 min inkubujte při pokojové teplotě.

4. Ke 5μl směsi nukleotidů přidejte 45 μl vody. Koncentrace by měla být cca 8 ng/μl.

5. V poměru 4:3 až 6:1 smíchejte oligonukleotidy s vektorem, který byl předtím rozštěpen vybranými restriktázami. Tj. ke 100 ng vektoru přidejte 75 až 600 ng oligonukleotidů.

6. Přidejte T4DNA ligázu, pufr. Ligační reakci proveďte standardně.