Syntéza cDNA

 

cDNA (complementary cDNA) je DNA syntetizovaná podle RNA v reakci katalyzované enzymem reverzní transkriptázou. Reverzní transkriptáza je RNA-dependentní DNA polymerázy. Především je tato technika využívaná pro přepis mRNA do DNA.

U eukaryotických organismů mRNA vzniká post-transkripční úpravou pre-mRNA, která je syntetizovaná při samotné transkripci genu. Při post-transkripční modifikaci jsou odstraněny introny, je dodána 5’metyl guaninová čepička a při procesu zvaném polyadenylace je také na 3’ konec přidán tzv. poly-A konec. Poly-A konec je úsekem za sebou uspořádaných adenosin monofosfátů. Vzhledem k odstranění intronů při post-transkripční modifikaci, syntézou cDNA získáváme kódující sekvenci daného genu, tj. sekvenci bez intronů.

—————————————————————————————————————————–

ZÁKLADNÍ POSTUP PŘI PŘÍPRAVĚ cDNA

 

Syntéza cDNA se odvíjí v těchto krocích:

1. krok: Příprava kvalitní RNA nebo mRNA

2. krok: Samotná syntéza cDNA

3. krok: Ověření správnosti syntézy pomocí PCR

 ——————————————————————————————————————————

 SYNTÉZA REVERZNÍ TRANSKRIPTÁZOU

  Reversní transkriptáza je DNA polymeráza, která dle molekuly RNA syntetizuje molekulu DNA

 Reversní transkriptáza  přisedá k jednořetězcovému (templátovému) úseku RNA. 

Reversní transkriptáza se při svém startu potřebuje „odrazit“ od krátkého oligonukleotidu (primeru), který je díky své komplementaritě navázán na templátový jednořetězcový úsek. Syntéza probíhá od místa navázaného primeru.

  Od místa přisednutí primeru reversní transkriptáza syntetizuje k templátové molekule RNA komplementární řetězec DNA.  Syntézou tedy vzniká dvouřetězcová hybridní molekula DNA-RNA.Nově syntetizovaný řetězec DNA je označován jako 1. vlákno cDNA.


——————————————————————————————————————————

PRIMERY

Pro iniciaci syntézy jsou nejčastěji jako primery  využívány poly-dT (komplementární úseky k poly-A, které je na konci každého genu) nebo se využívá směs náhodných hexanukleotidů. Mohou se použít i oligonukleotidy, které jsou specifické ke konkrétní sekvenci daného genu.

——————————————————————————————————————————

2. VLÁKNO cDNA

Činností reverzní transkriptázy se podle molekuly RNA vytváří 1. vlákno cDNA a tím vzniká hybridní dvouvláknová molekula RNA-DNA. Vlákno RNA se odstraní pomocí RNázy H, čímž se získá jednořetězcová molekula DNA.

 

Pomocí PCR reakce se k takto připravenému 1. vláknu cDNA  syntetizuje 2. vlákno cDNA. Reakcí vzniká dvouvláknová molekula DNA.

——————————————————————————————————————————

REAKČNÍ FÁZE

cDNA

Denaturace RNA při 65 oC. RNA je denaturována pro odstranění sekundárních struktur, které zde mohou být na její molekule formovány vzhledem k   jednořetězcové struktuře RNA.

 

Syntéza prvního řetězce cDNA. Syntéza probíhá podle řetězce RNA prostřednictvím reverzní transkriptázy, která pro iniciaci syntézy využívá  poly-dT komplementárních k poly-A koncům, případně hexanukleotidy či specifické oligonukleotidy a syntézu provádí pomocí dodaných dNTP (směsi nukleotidů). Výsledkem reakce je DNA-RNA molekula.

 

Odstranění řetězce RNA z molekuly DNA-RNA. Pro odstranění RNA řetězce je využívána  RNasa H.

 

Syntéza druhého vlákna prostřednictvím PCR. Pro syntézu druhého vlákna je využívaná klasická PCR s primerem specifickým pro cílový úsek.

 

 

 

——————————————————————————————————————————

POSTUP PŘI PŘÍPRAVĚ cDNA

Uvádíme zde sice nejčastěji používaný postup přípravy cDNA, ale dle doporučení výrobce zvolené reverzní transkriptázy se konkrétní postupy mohou mírně lišit.

 

Reakce:

Syntéza 1. vlákna cDNA:

Dle uvedené tabulky připravte směs RNA, primeru, dNTP, doplňte vodou tak, aby objem celé reakce po doplnění všech dalších komponent byl 20 μl.

Jako templát by měla být používaná RNA bez jakékoliv kontaminace genomovou DNA. Při izolaci RNA se proto doporučuje zahrnout krok s působením DNázy.

 

Pro každý testovaný vzorek připravte paralelně jeho negativní kontrolu (tzv. RT(-)). Pro vzorek negativní kontroly použijete všechny komponenty jako použijete u daného vzorku až na reverzní transkriptázu. Při přípravě negativní kontroly zacházíte identickým způsobem jako s testovanými vzorky.   Kontrola RT(-) nám ukáže, jestli ve vzorku RNA, který byl použit pro přípravu cDNA, nebyla kontaminace genomovou DNA. Příprava kontroly RT(-) je doporučována zejména tehdy, pokud jsou vzorky cDNA využívány ke kvantifikaci transkripce pomocí kvantitativní Real-time PCR.

 cDNA

RNA denaturujte inkubací připravené směsi při 65 oC 5 min., poté rychle vložte na led a nechte inkubovat alespoň 1 min.

Přidejte pufr, DTT, RNase inhibitor a na závěr reverzní transkriptázu. Lehce promíchejte, krátce centrifugujte.

Nechte inkubovat 50 min při 42 oC (teplota a délka inkubace závisí na typu reverzní transkriptázy).

Ukončete reakci inkubací v 70 oC 15 min. Zchlaďte na ledu a centrifugujte.

Přidejte 1 µl RNasy H a inkubujte v 37 oC po 20 min.

 

Syntéza 2. vlákna cDNA:

Syntéza 2. vlákna cDNA probíhá pomocí standardní PCR s primery k cílovému genu.

 

Ověření syntézy cDNA:

Produkty PCR a tedy syntézu cDNA ověříte elektroforetickou separací. Pokud jste připravovali také negativní kontrolu RT(-), v této negativní kontrole byste po PCR reakci  neměli dostat žádný produkt PCR. A pokud  produkt vznikne, je to na základě kontaminace genomovou DNA, a to pozůstatkem genomové DNA ve vzorku RNA.