Spektrofotometrické vyhodnocení nukleových kyselin

SPEKTROFOTOMETRICKÉ VYHODNOCENÍ NUKLEOVÝCH KYSELIN

Roztok nukleových kyselin se spektrofotometricky vyhodnocuje při vlnové délce 260nm a 280nm. Absorbance při 260 nm odráží koncentraci nukleové kyseliny, absorbance při 280 nm odráží její čistotu, tj. míru přítomnosti proteinů.

 

Pro výpočet koncentrace se vychází z následujících vztahů:

Při vlnové délce 260 nm je absorbance roztoku rovna 1, pokud je v měřeném roztoku:

– dvouřetězcová DNA o koncentraci 50 µg/ml

– jednořetězcové DNA o koncentraci 37 µg/ml při 260nm DNA je rovna 1

– RNA o koncentraci 40 µg/ml při 260nm DNA je rovna 1

 

———————————————————————————————————————————————————–

POSTUP PŘI SPEKTROFOTOMETRICKÉM VYHODNOCENÍ

1. Roztok nukleové kyseliny se naředí. Obvykle je to buď 50x nebo 100x nebo 1000x. Protože přesnější měření získáme při vyšší koncentraci roztoku, je míra ředění  kompromisem mezi přesností měření a množstvím nukleové kyseliny, které kvůli měření ztratíme. Směrodatným faktorem je rovněž typ a velikost spektrofotometrické kyvety a typ spektrofotometru (tj. především výška probíhajícího paprsku).

Roztok nukleové kyseliny tedy naředíme např. 100x, tj. 1:100. Roztok důkladně promícháme.

 

2. Nejprve spektrofotometr vynulujeme oproti slepému vzorku („blank“), kterým je obvykle voda, která byla použita pro ředění roztoku.               

 

3. Změříme absorbanci roztoku DNA či RNA při 260 nm a poté při 280nm. Výsledná hodnota je např. A260=0,02 a A280=0,009.                                                                   

 

4. Vypočteme poměr A260/A280, který nám poskytuje informaci o čistotě roztoku. Čistá DNA obvykle vykazuje hodnotu tohoto poměru okolo 1,8, u RNA je to okolo 2. Pokud hodnota poměru je výrazně nižší, je roztok kontaminován proteiny či fenolem. V našem případě je A260/A280=2,2.

 

5. Vypočteme koncentraci nukleové kyseliny dle A260 a vztahu uvedeného v textu výše a míře naředění roztoku DNA.

 

V našem případě tedy 50 x 0,02 x 100 = 100 µg/ml = 100ng/µl

                                

                                 Obecně pro ds DNA:   50 x A x ředění = ng/µl

                                 Obecně pro ss DNA:   37 x A x ředění = ng/µl                    

                                 Obecně pro RNA:        40 x A x ředění = ng/µl                

 

Při měření více vzorků a také po skončení měření dbáme na důkladné vypláchnutí spektrofotometrické kyvety.   

 

 

Literatura:

Barbas et al. (2007) Quantitation of DNA and RNA – Cold Spring Harbor Protocols.