Problémy s PCR

Jaké jsou nejčastější problémy s PCR a jak je řešit?

Produkt v negativní kontrole:

Způsobeno kontaminací buď při přípravě reakce nebo kontaminací přímo v některé chemikálii.

 

Žádný nebo slabý produkt:

Snižte teplotu nasedání primerů

Zvyšte koncentraci primerů nebo množství templátové DNA nebo Taq polymerázy.

Změňte koncentraci KCl. Zvyšte koncentraci, pokud očekávaný produkt je kratší než 1 kb, nebo koncentraci snižte, pokud očekávaný produkt je delší než 1 kb.

Přidejte BSA na koncentraci 0,1 – 0,8 µg/µl.

Zkontrolujte správnost sekvence primerů.

Můžete zkusit kombinaci bodů 1-5.

Dlouhé nespecifické produkty:

Snižte čas nasedání primerů.

Zvyšte teplotu nasedání primerů.

Snižte čas extense.

Snižte teplotu extense na 62 – 68 0C.

Zvyšte koncentraci KCl 1,2x – 2x, ale zachovejte koncentraci MgCl2 na 1,5 – 2 mM.

Zvyšte koncentraci MgCl2 na 3 – 4,5 mM ale zachovejte koncentraci dNTP stejnou.

Použijte méně primerů nebo templátu nebo Taq polymerázy.

Kombinujte všechny uvedené body.

Krátké nespecifické produkty:

Zvyšte čas nasedání primerů.

Zvyšte teplotu nasedání primerů.

Zvyšte čas extense.

Zvyšte teplotu extense na 62 – 68 0C.

Snižte koncentraci KCl 0,7 – 0,8x, ale zachovejte koncentraci MgCl2 na 1,5 – 2 mM.

Zvyšte koncentraci MgCl2 na 3 – 4,5 mM, ale zachovejte koncentraci dNTP stejnou.

Použijte méně primerů nebo templátu nebo Taq polymerázy.

Kombinujte body 1-7. Pro zvýšení specificity reakce můžete použít některou z modifikací PCR, jako je Hot-start PCR, nested PCR nebo Touch-down PCR.