Modifikace PCR

MODIFIKACE PCR

• hot-start PCR – zvyšuje specificitu reakce tím, že je využita speciálně upravená, tzv. hot-start polymeráza, která pro svou aktivizaci vyžaduje aktivační teplotu, tj. teplotu okolo 95oC.Při PCR, obvykle během nízkých teplot při zahřívání vzorku na teplotu počáteční denaturace, může docházet k nespecifickému nasedání primerů na templátovou DNA, a pokud je použita standardní Taq polymeráza, mohou z takto nespecificky nasednutých primerů vznikat nespecifické PCR produkty. Proto enzym, který je využit při hot-start PCR, je za nízkých teplot v počátcích reakce, na rozdíl od běžných polymeráz, zcela neaktivní. Enzym se aktivizuje až v průběhu reakce, tj. při počáteční denaturační teplotě. Odpadá tedy riziko vzniku PCR produktu z nespecificky nasednutých primerů při nízkých teplotách v průběhu přípravy reakce. Dalším způsobem hot-start PCR je přidání polymerázy až po první denaturaci.

 

touchdown PCR – využívá postupně se snižující se teploty nasedání primerů. V počátečních cyklech je teplota nasedání vysoká, čímž brání nespecifickému nasedání primerů, ale postupně se v dalších cyklech snižuje. Při dostatečně nízké teplotě dochází k nasedání primerů na specifická místa a vzniká PCR produkt. Ačkoliv se teplota nasedání primerů může v dalších cyklech ještě dále snižovat, specifický produkt, který vznikl v předcházejících cyklech, zajistí po zbytek reakce vznik pouze specifických produktů.

 

nested PCR – slouží pro zvýšení specificity reakce, kdy se využívají dva páry primerů. Jeden pár vnějších primerů a jeden pár vnitřních primerů. Vnitřní primery nasedají na sekvenci, která je ohraničena vnějšími primery. Nejprve se provede reakce s vnějšími páry primerů a vzniklý produkt je využit jako templát pro reakci s vnitřními primery. Kombinací dvou párů primeru se zvýší pravděpodobnost amplifikace pouze daného, specifického úseku.

 

inverzní PCR – je využívaná pro izolaci a identifikaci neznámé sekvence, uvnitř níž leží známá sekvence. DNA je štěpená restrikčním enzymem, který ovšem nesmí štípat  uvnitř známé sekvence. Získané fragmenty se poté ligací cirkularizují. Vzniklé cirkulární formy jsou štěpeny restrikčním enzymem štěpícím ve známé sekvenci, čímž se molekula linearizuje. Úseky známé sekvence se při linearizaci dostávají na konce molekuly. Neznámá sekvence leží uprostřed molekuly. Známá sekvence na koncích molekuly poté slouží jako templátová sekvence pro PCR.

 

 

asymetrická PCR – slouží k produkci preferenčně jednoho vlákna, např. pro sekvenování. Vzniku jednoho vlákna je nejčastěji docíleno poměrem primerů, který je 1:50 až 1:100.

 

multiplex PCR – metoda využívá v jedné reakci více než jeden pár primerů, které se váží k různým úsekům templátové DNA. Reakce tedy běží s více primery nejednou, vzniká více různých produktů, které potom analyzujeme.

 

kvantitativní real-time PCR – metoda kvantifikace DNA či kvantifikace transkripce. Kvantifikace je na základě fluorescence, a to buď pomocí fluorescenčního substrátu, který se zabudovává do dvouřetězcového PCR produktu v průběhu reakce nebo se využívá speciálních fluorescenčně značených sond.Detailní informace o kvantitativní PCR naleznete zde.

 

RT-PCR – PCR, kdy se jako templát využívá cDNA, tj. molekula DNA vzniklá přepisem RNA pomocí reverzní transkriptázy. Využívá se při vyhodnocování genové exprese.

 

alelověspecifická PCR – na základě sekvence primerů se tato metoda využívá k identifikaci mutací v sekvenci DNA. Na základě změny v sekvenci, se primery váží/neváží k templátové sekvenci a tím produkt vzniká/nevzniká, což udává přítomnost/ nepřítomnost dané mutace v testované sekvenci.

 

 

mutageneze pomocí PCR – metoda se využívá ke vnášení změn do sekvence DNA připravovaného PCR produktu, a to pomocí pozměněné sekvence primerů (na jejich 3’ konci).