Izolace genomové DNA pomocí fenol-chloroformu

 

IZOLACE POMOCÍ FENOL- CHLOROFORMU

Izolace pomocí fenol-chloroformu je klasickým způsobem izolace DNA. Tato izolace je poměrně pracná a zdlouhavá, ale poskytuje velké množství velmi čisté DNA.

K lyzátu, který se ponejprv získá rozrušením tkání a buněk, a působením proteázy, se postupně přidává fenol či směs fenolu a chloroformu, které z lyzátu vyváží proteiny. Přidáním těchto látek k vodnému roztoku dojte k  separaci roztoku do dvou fází. Horní fáze je vodný roztok obsahující DNA, spodní je pak organická fáze fenolu či chloroformu. Mezi vodnou a organickou fází se hromadí proteiny.

Princip této metody tkví v tom, že DNA se díky své polaritě ochotně rozpouští v polárním vodném roztoku. Naproti tomu je fenol v porovnání s vodou daleko mnohem méně polární, a proto se v něm DNA rozpouští mnohem hůře. Co se týče ale proteinů, jejich polarita je dána jednotlivými aminokyselinami, a proto část řetězce je více polární a část méně polární. Část řetězce daného proteinu by se ráda rozpustila ve vodě a část ve fenolu. Z toho důvodu se proteiny hromadí na rozhraní mezi vodným roztokem a organickou fází. Opakovaným přidáváním fenol/chloroformu  a postupným odebíráním a přečišťováním vrchní fáze, dochází k postupnému pročišťování roztoku DNA od proteinů.

——————————————————————————————————————————-

ZÁKLADNÍ POSTUP PŘI IZOLACI DNA FENOL-CHLOROFORMEM

Mechanické rozrušení tkání/pletiv

Rozrušení celistvosti buněk a natrávení proteinů pomocí lyzačního roztoku (komponenty lyzačního roztoku viz. Izolace genomové DNA)

Opakované pročišťování roztoku od proteinů pomocí fenol-chloroformu v kombinaci s

   centrifugací

Precipitace DNA pomocí přídavku etanolu a octanu sodného a extrakce DNA z roztoku (viz. Precipitace DNA)

Příprava výsledného roztoku DNA rozpuštěním DNA ve vodě či pufru

Kontrola integrity DNA elektroforetickou separací

Stanovení koncentrace DNA v získaném roztoku

  Fenol extrakce

 

 ——————————————————————————————————————————–

VVYUŽITÍ FENOL-CHLOROFORMU PŘI:

Izolaci DNA z živočišných tkání

Izolaci DNA z rostlinných pletiv

  Přečištění (purifikace) roztoku DNA

 ——————————————————————————————————————————–

   


                                                                            Izolace DNA z živočišných tkánísipka

                                                                            Izolace DNA z rostlinných pletiv

 

 ——————————————————————————————————————————–

Literatura:

Green M., Sambook J. (2012) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Laboratory Press. 4 vydání. ISBN-10: 1936113422