Izolace DNA pomocí chelexu

IZOLACE DNA POMOCÍ CHELEXU

Extrakce DNA pomocí Chelexu 100 je velmi používanou metodou ve forenzní genetice pro izolaci DNA z miniaturního množství vzorků (vlasy, krevní stopy, stopy slin). Tato metoda je velmi rychlá a poměrně levná a poskytuje dostatečné množství DNA pro její vyhodnocení PCR reakcí. DNA izolovaná touto metodou není dostatečně čistá, a proto se kromě PCR pro další aplikace nehodí.

 Chelex je pryskyřice složená ze styren divinylbenzen kopolyméru obsahující párové iminodiacetátové ionty. Tyto ionty působí chelatačně a váží polyvalentní kovové ionty. Pro izolaci DNA je především důležité vyvazování („inaktivování“) Mg2+ iontů. Tyto ionty jsou totiž jednak nezbytné pro aktivitu nukleáz (např. DNáz degradujích DNA) a také mohou při vysoké teplotě (95 – 100 °C) vést k poškození DNA.

Základními kroky při izolaci DNA pomocí chelexu jsou:

homogenizace vzorku,

destrukce buněčných komponent alkalickým prostředím a vysokou teplotou,

separace roztoku obsahujícího DNA od zbytků buněčných komponent a pryskyřice chelexu.

————————————————————————————————————————————–

POSTUP PŘI IZOLACI

Připravíme si 5% roztok chelexu o dostatečném objemu. Při přípravě chelexu máme na paměti, že partikule chelexu snadno klesají ke dnu, takže před použitím musíme roztok s chelexem řádně promíchat.

Přidáme testovaný vzorek, provedeme homogenizaci například plastovým tloučkem a přidáme Proteinázu K tak, aby její výsledná koncentrace byla 0,5 μg/μl. Promícháme a inkubujeme 10 min při 56 °C.

Poté promícháme vortexem 10 – 15 sekund a inkubujeme 10 min při 95 – 100 °C. Vzorky promícháme a centrifugujeme při maximální rychlosti 5 min, při pokojové teplotě.

Horní fázi přendáme do čisté zkumavky a dále vyhodnocujeme pomocí PCR.

Vždy dbáme na to, aby reakce PCR neobsahovala příměsi chelexu, protože chelex PCR reakci inhibuje.