Precipitace nukleových kyselin

PRECIPITACE DNA

Metoda precipitace (vysrážení) DNA je využívaná ve chvílích, kdy máme daný roztok DNA a potřebujeme jej vyčistit od případných příměsí (nejčastěji solí) nebo zvýšit koncentraci DNA (roztok zahustit).

 

Základními kroky jsou:

1. krok: Dodání monovalentních kationtů k roztoku DNA tak, aby byla získaná patřičná finální koncentrace

2. krok: Přidání alkoholu, nejčastěji v objemu, který je 2 – 2,5x větší než je objem roztoku DNA

3. krok: Centrifugace* a získání sedimentu DNA na dně zkumavky. Promytí sedimentu a jeho vysušení.

4. krok: Rozpuštění sedimentu DNA ve vodě nebo TE pufru.

* v případě velkého množství DNA se DNA po přidání alkoholu zformuje do viditelného klubíčka a není třeba centrifugace; klubíčko může být přeneseno pro promývací krok do další zkumavky sterilním háčkem či špičkou

 

Nejčastěji se provádí precipitace s využitím octanu sodného (Na-acetátu) a etanolu. Nicméně k precipitaci lze využít také jiné soli než octan sodný (uvádíme v tabulce) a precipitaci provádět v izopropanolu místo etanolu.

Při precipitaci by roztok s DNA měl obsahovat koncentraci monovalentních kationtů dle uvedené tabulky.

tab precipitace

V případě malého množství DNA může být sediment DNA po centrifugačním kroku špatně viditelný. Proto v případech, kdy pracujeme s malým množstvím DNA (< 2 μg), se při precipitaci doporučuje přidávat látky jako je glykogen nebo případně i t-RNA (ovšem méně vhodná), které DNA sediment zviditelní.

Tip   Pro zvýšení účinnosti precipitace, a to zejména při nízké koncentraci DNA v roztoku, je doporučováno provádět precipitaci za snížené teploty. Tj. používat předchlazený alkohol na -20 °C, nechat DNA precipitovat v -20 °C a rovněž centrifugační kroky provádět za snížené teploty (alespoň 4 °C).

——————————————————————————————————————————-

POSTUP PRECIPITACE DNA S VYUŽITÍM OCTANU SODNÉHO

Využití octanu sodného v kombinaci s etanolem je nejčastějším způsobem precipitace DNA. Provádí se následovně:

1. K precipitaci použijte 3 M octan sodný. Octanu sodného přidejte o objemu cca 1/10 finálního objemu roztoku (např. pokud máte 500 μl roztoku DNA, přidejte 55 μl 3 M octanu sodného). V případě, že pracujete s malým množstvím DNA (< 2 μg), přidejte pro snadnější zviditelnění sedimentu v následném centrifugačním kroku glykogen (0,5 μl glykogenu o koncentraci 50 mg/ml do roztoku DNA o objemu 500 μl) nebo t-RNA (o finální koncentraci 50 μg/ml).

2. Přidejte 2 – 2,5 objemy 100% etanolu (nejlépe předchlazeného), dobře promíchejte. Pro zvýšení účinnosti inkubujte nejméně hodinu v -20 °C .

3. Centrifugujte při 4 °C při alespoň 13 000 rpm 20 min.

4. Odstraňte supernatant a přidejte stejný objem 75% etanolu. Centrifugujte při 4 °C při alespoň 13 000 rpm 2 min.

5. Odstraňte supernatant a zbytky etanolu nechte odpařit.

6. Rozpusťte získaný sediment ve vodě nebo TE pufru.

 

DNA se v etanolu, který je o koncentraci > 70% nerozpouští. Tzn., pokud je z nějakého důvodu koncentrace přidávaného alkoholu nedostatečná, jednak nedojde k precipitaci a jednak, pokud je alkohol přidáván k již vytvořenému sedimentu DNA, dojde k rychlému rozpuštění sedimentu a ztrátě DNA.

————————————————————————————————————————————–

PRECIPITACE RNA

Precipitace RNA se provádí obdobným způsobem jako precipitace DNA, krom toho, že všechny použité roztoky nesmí obsahovat kontaminaci RNáz, např. musí být ošetřeny proti přítomným RNázám pomocí DEPC.