Purifikace pomocí fenol-chloroformu

PURIFIKACE NUKLEOVÝCH KYSELIN POMOCÍ FENOL-CHLOROFORMU

Jedná se o klasickou metodu purifikace nukleových kyselin od proteinových příměsí s využitím fenol-chloroformu v kombinaci s precipitací nukleové kyseliny nejčastěji octanem sodným a etanolem.Detailní informace o použití fenol-chloroformu při extrakci  nukleových kyselin  najdete zde.

Postupuje se následovně:

 

1. Nejprve provedeme přečištění pomocí fenol-chloroformu

K purifikovanému roztoku nukleové kyseliny přidáme stejný objem fenolu (případně fenol-chloroformu-isoamylalkoholu (25:24:1)) jako je objem roztoku. Pokud pracujeme s fragmenty DNA či RNA, roztok krátce zvortexujeme. Pokud pracujeme s genomovou DNA a máme zájem o co nejlepší zachování její integrity, roztok necháme zvolna promíchávat v horizontálním směru 15 min při pokojové teplotě. Centrifugujeme 10 min při 6000 g.

 

vykricnik pH použitého fenolu musí být 8. Fenol vhodný pro izolaci DNA lze již přímo koupit nebo si ho lze v laboratoři připravit.

 

Odebereme horní fázi a dáme ji do čisté zkumavky. Přidáme stejný objem chloroformu-isoamylalkoholu (24:1) a opakujeme předcházející krok.

Dle potřeby můžeme předcházející krok opakovat 1 – 2x.

 

vykricnik V roztoku, z něhož je DNA následně precipitována, nesmí být zbytky fenolu či chloroformu, které by mohly jednak narušit účinnost následné precipitace, jednak by kontaminovaly výsledný roztok DNA. Aby bylo zajištěno, že v roztoku nezbude žádný fenol či chloroform, je doporučováno roztok ještě jednou centrifugovat, do čisté zkumavky odebrat většinu roztoku opatrným pipetováním a to s tím, že na dně zkumavky je ponechán malý zbytek roztoku, který se pak vyhodí.

 

2. Poté provedeme DNA precipitaci

Pro precipitaci DNA přidáme 1/10 objemu 3 M Na-acetátu (pH 5,2) a 2,5x objem 100% etanolu a promícháme. Pokud pracujeme s malým množstvím DNA (< 2 μg), pro snadnější zviditelnění sedimentu v následném centrifugačním kroku přidejte glykogen (0,5 μl glykogenu o koncentraci  50 mg/ml do roztoku DNA o objemu 500 μl) nebo t-RNA (o finální koncentraci 50 μg/ml).

Roztok centrifugujeme 10 min při 13 000 rpm. Centrifugací se vytvoří pelet DNA na dně zkumavky.

Odstraníme horní vrstvu etanolu a přidáme stejný objem 75% etanolu, centrifugujeme (13 000 rpm, 10 min, 4 °C).

 

Důkladně odstraníme etanol, krátce (5 min.) necháme vyschnout (kapky etanolu usazené po stěnách můžeme případně krátce centrifugovat a odsát pipetou) a sediment DNA rozpustíme ve vodě nebo TE pufru.

 

Tip Intenzitu precipitace můžeme zvýšit jednak tím, že 100% etanol, který použijeme k precipitaci, je předchlazen na -20°C nebo také uložením vzorku po přidání etanolu a octanu sodného do -20 °C na více než 1 hodinu, případně do -80 °C na hodinu 

Detailnější informace o precipitaci nukleových kyseli najdete zde.