Izolace genomové DNA

sipka vlevo   Izolace nukleových kyselin z tkání

———————————————————————————————————————————-

IZOLACE GENOMOVÉ DNA

 

Proces izolace či extrakce DNA je získávání DNA z daného vzorku za použití kombinace chemického a fyzikálního přístupu.

Při izolaci genomové DNA postupujeme v těchto krocích:

1. Rozrušení tkáně za použití tloučků, homogenizátorů či sonikátoru

 

2. Rozrušení celistvosti buněk buněčnou lyzí pomocí lyzačních roztoků a natrávení

    proteinů pomocí přidané proteázy.

 

   Komponenty lyzačního roztoku:

  • U baktérií a rostlinných buněk je důležité nejprve rozrušit buněčnou stěnu. Toho docílíme tím, že do lyzačního roztoku přidáme lysozym nebo CTAB nebo celulázu. U živočišných buněk stačí destabilizovat buněčnou membránu slabými neiontovými detergenty (např. 0,5% SDS), které způsobí snížení osmolarity a popraskání buněk.

  • V lyzačním roztoku je rovněž přítomná proteáza (nejčastěji Proteináza K), která natráví přítomné proteiny, a RNáza pro odstranění RNA.

  • Přítomná je EDTA, tzv. chelatační činidlo, která vyvazuje dvojmocné kationty, které jsou jinak důležité pro aktivitu enzymů deoxyribonukleáz (DNáz). Pokud by nedošlo v roztoku k vyvázání dvojmocných iontů, došlo by vlivem působení DNáz k degradaci DNA.

 

3. Separace DNA od proteinů a dalších příměsí

4. Získání roztoku DNA

5. Kontrola celistvosti DNA elektroforetickou separací

6. Stanovení koncentrace DNA v roztoku

———————————————————————————————————————————-

ZPŮSOBY JAK IZOLOVAT GENOMOVOU DNA

pomocí fenol-chloroformu

pomocí gravitačních kolonek

pomocí chelexu (v případě DNA)

pomocí komerčních produktů založených na bezkolonkovém přístupu

——————————————————————————————————————————–

  

                                           

                                           Izolace genomové DNA pomocí fenol-chloroformu

                                           Izolace genomové DNA pomocí gravitačních koloneksipka

                                              Izolace genomové DNA pomocí chelexu