ELFO v polyakrylamidovém gelu

 

Elektroforetická separace

sipka vlevo

—————————————————————————————————————————————————————

ELEKTROFORETICKÁ SEPARACE V POLYAKRYLAMIDOVÉM GELU (polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)

Při přípravě polyakrylamidového gelu lze výběrem vhodné koncentrace akrylamidu a bisakrylamidu ovlivňovat velikost pórů gelu a tím optimální separaci fragmentů DNA o určité délce. Se zvyšující se koncentrací těchto látek se póry gelu stávají menšími a tím se gel hodí pro separaci menších molekul, viz. tabulka.  Pro PAGE je jako elektroforetický pufr využíván TBE.

PAGE je buď ve formě denaturační s přídavkem denaturační látky, jako např. 0,8M močoviny nebo ve formě nedenaturační, tzv. nativní.

 

page gel

Koncentrace polyakrylamidového gelu pro separaci nukleových kyselin. Doporučené hodnoty pro dané aplikace jsou zvýrazněny tučně.

 

Příprava elektroforetické aparatury:

Saponátem a vodou se důkladně umyjí skla, plastové vložky a hřebínek, poté se skkla důkladně opláchnou deionizovanou/destilovanou vodou a etanolem a nechají se uschnout.

  vykricnik Se skly se manipuluje jen v rukavicích, přičemž se skla drží za jejich okraje. Skla nesmí být jakkoliv znečištěna. Znečištění vede k tvorbě bublin při nalévání gelu.

Skla se sestaví k sobě, vloží boční vložky, okraje skel se mohou olepit izolepou pro ujištění, že nedojte k vytečení roztoku gelu. Skla se zajistí svorkami a vloží se vertikálně do připravené aparatury.

Příprava roztoku gelu s požadovanou koncentrací (viz. tabulka dole):

Odměří se požadovaný objem vody

Pokud se připravuje denaturační gel, přidá se močovina tak, aby její finální koncentrace byla 0,8M.Přičemž  roztok důkladně promícháme a ujistíme se, že je močovina důkladně rozpuštěná.

Do roztoku se přidá množství akrylamidu/bisakrylamidu dle požadované koncentrace gelu (viz. tabulka nahoře)

Přidá se TBE, tak aby jeho finální koncentrace byla 1X

Přidá se APS, tak aby jeho finální koncentrace byla 0,05 %. Roztok důkladně promíchejte.

Nakonec se přidá TEMED tak, aby jeho finální koncentrace byla 0,05 %. Rychle a důkladně promícháme. Po přidání TEMEDu pracujeme urychleně, protože již začíná polymerizace.

Pipetou naneseme roztok mezi připravená skla a vložme hřebínek. Ujistíme se, že nedochází k vytékání roztoku. Necháme polymerizovat 30-60 min při pokojové teplotě.

Složení gelu pro denaturační PAGE:

gel akrylamid2

 

Složení gelu pro nativní PAGE:

page gel 3

vykricnik Při práci s akrylamidem je třeba obezřetnosti, protože působí jako neurotoxin.

 

Po ukončení polymerizace odstraníme svorky, případně izolepu, vložíme do aparatury a vlijeme elektroforetický pufr TBE.

vykricnik Je doporučeno používat TBE ze stejné lahve pro přípravu gelu  jako pro pufr do elektroforetické vany. Malé rozdíly v koncentraci solí mohou mít velký vliv na migraci nukleové kyseliny.

Opatrně odstraníme hřebínek a ihned pipetou s tenkou špičkou důkladně propláchneme jamky tak, aby se odstranily zbytky nezpolymerizovaného roztoku, který zůstal v jamkách a výsledné proužky byly tak rovné. Necháme běžet elektroforézu naprázdno, tj. bez vzorků 15-30 min při 1-8 V/cm.

Smícháme roztok nukleové kyseliny s nanášecím pufrem a tenkou špičkou naneste vzorky. Naneseme velikostní marker. Necháme elektroforézu běžet při 1-8 V/cm, až se barvička nanášecího pufru dostane do požadované vzdálenosti.

Vypneme elektroforézu, odstraíme boční vložky a oddělíme skla od sebe pomocí vložení plastového či kovového „klínku“ (např. staré platební karty). Opatrně sundáme gel a necháme jej barvit např. pomocí etidium bromidu.