ELFO v agarosovém gelu

Elektroforetická separace

sipka vlevo

————————————————————————————————————————————————————————————————————–

ELEKTROFORETICKÁ SEPARACE V AGAROSOVÉM GELU

 

Potřeby: zdroj elektrického napětí, elektroforetická vana, vanička, hřebínek, agarosa, elektroforetický pufr TAE nebo TBE, nanášecí pufr, velikostní marker (tzv. ladder).

SCHEMA ELFO APARATURY  

Příprava gelu a elektroforetické vaničky:

Množství připravovaného gelu závisí na počtu vzorků a tedy velikosti vaničky a délce hřebínku.

Koncentrace gelu závisí na typu fragmentů DNA, které chceme separovat, viz. tabulka. Pro většinu aplikací se ale používá 1% agarozového gelu. Takže, např. pro 40 ml 1% agarozového gelu použijeme 40 ml 1X TAE pufru nebo 1X TBE pufru a 0,4 g agarozy.

agar konc2

 

Agarózu smícháme s pufrem nejlépe ve skleněné lahvi se šroubovacím víčkem, lahev uzavřeme tak, že víčko necháme částečně povolené, nebo roztok můžeme připravit v Erlenmayerově bance, přičemž hrdlo přikryjeme plastovou folií, kterou perforujeme pro snadnější odchod páry. Velikost lahve musí být alespoň 2x větší než je objem připravovaného gelu.  

Agarózu nejsnadněji rozpustíme v mikrovlnné troubě, obvykle stačí 1-1,5 min nebo ji lze rozpustit klasicky na plotýnce. V průběhu rozehřívání můžeme 1-2x roztokem zamíchat. Agaroza musí být dokonale rozpuštěna, tzn., nesmí být patrná žádná zrnka tající agarózy.

Připravený gel necháme zchladnout tak, aby již nebyl vařící, ale přesto dostatečně horký na to, aby nezačal tuhnout. Pokud nám gel nedopatřením ztuhne, můžeme ho opětovně rozpustit.

Připravíme si ELFO vaničku, jejíž čela jsme předtím důkladně oblepili lepicí páskou  či izolepou (v některých případech jsou vaničky dodávány s kovovými pásky, kterými vaničku utěsníme, či je dodáván jiný „utěsňovací“ systém).Do vaničky vložíme ELFO hřeben a vlijeme agarozový gel, který poté necháme dokonale ztuhnout. Po ztuhnutí odstraníme z vaničky utěsnění a vyndáme hřeben.

Vaničku usadíme do elektroforetické vany, a to tak, aby jamky byly u záporného pólu. Gel s vaničkou zalijeme 1x ELFO (1x TAE nebo 1x TBE) roztokem. Hladina ELFO roztoku by měla být těsně (1-2 mm) nad gelem.

 

vykricnik V některých laboratořích se přidává do gelu etidium bromid, který nám v závěrečné fázi umožní vizualizaci DNA či RNA. Nicméně jelikož je etidium bromid mutagen, z bezpečnostního hlediska (kvůli odpařování a kontaminaci laboratorního prostředí) je doporučováno gel barvit až po elektroforéze. Rovněž etidium bromid nepatrně ovlivňuje mobilitu DNA, což v některých případech experimentů není žádoucí.

Příprava vzorků a jejich nanášení:

Ke vzorkům přidáme nanášecí pufr (složení najdete zde).  Množství dodaného pufru se odvíjí od jeho koncentrace. Pokud je koncentrace nanášecího pufru 10x, ke vzorkům přidáme pufru o objemu jedné desetiny finálního objemu roztoku. Vzorky promícháme.

 

Tip Je výhodné míchat vzorky s nanášecím pufrem na kousku parafilmu místo klasicky ve zkumavce.Ušetří to čas i zkumavky.

 

Připravené vzorky naneseme do jamek, přičemž díky přítomnosti glycerolu vzorky klesnou na dno jamky. Aby byly jamky lépe zřetelné, pro snadnější nanášení podložíme elektroforetickou vanu tmavým papírem. Pro nanášení používáme 1-20µl pipety, které mají obvykle jemnější chod než pipety na větší objemy a nanášení vzorků je s nimi proto snadnější.

Do jedné z jamek rovněž naneseme velikostní marker. Objem nanášeného markeru je doporučován výrobcem.

Separace vzorků:

ELFO vanu přikryjeme víkem a zapneme ELFO zdroj. Nastavíme napětí tak, aby bylo 5-8V/cm mezi elektrodami. Elektroforézu necháme běžet maximálně tak dlouho, až je bromfenolová modř ve 2/3 až ¾ délky vaničky.

 

Barvení vzorků (pokud nebyla barvička přidaná přímo již do elektroforetického gelu):

Gel vyjmeme z vaničky a ponoříme ho na 10-20 min. do vodného roztoku etidium bromidu (20µl 1%EtBr ve 100ml H2O), případně GelRed či SyberGreenu.

Zásobní roztok etidium bromidu bývá 1%, tj. 10mg/ml. Pracovní roztok skladujeme ve tmě a lze jej využívat opakovaně.

Během barvení roztokem protřepáváme.

Po obarvení opatrně gel z barvícího roztoku vyjmeme, opláchneme vodou a vizualizujeme pod UV světlem. Pro zvýšení kontrastu, lze po ukončení ELFO nežádoucí pozadí odstranit promýváním gelu ve vodě po dobu cca 10 min.