Klasické metody sekvenování

MAXAM-GILBERTOVA METODA

Tato metoda využívá chemického štěpení jednotlivých typů bází. Metoda pracuje s jednovláknovou DNA, která je na svém jednom konci (3’ nebo 5’) radioaktivně značena. Reakce je prováděna ve čtyřech zkumavkách, přičemž v každé zkumavce je prováděno štěpení jen určitých typů bází. To znamená, že DNA se štěpí jen v místě určitých bází. Tím vzniká směs různě dlouhých fragmentů, které končí v místě určité báze a jejich elektroforézou v hustém polyakrylamidovém gelu, kdy jsou všechny čtyři reakce naneseny vedle sebe, určíme rozdíly v délce fragmentů, a tedy určíme, jak daleko od začátku fragmentu tato báze byla. Odečtením pozice jednotlivých bází ve všech čtyřech reakcích stanovíme sekvenci daného úseku.

 mAXAM gILBERTOVA METODA

SANGEROVA METODA

Sangerova metoda využívá proces replikace DNA a tedy princip využívaný také při PCR.Původní a klasické provedení metody je prováděno tak, že:

k jednořetězcové DNA přisedá 15-25 bp dlouhý primer (značený radioaktivně), který je komplementární k začátku sekvenovaného místa,

od navázaného primeru probíhá syntéza DNA za přítomnosti dNTP (dATP, dCTP, dGTP a dTTP) a jednoho z dideoxynukleotidů (ddATP, ddCTP, ddGTP nebo ddTTP). Jednotlivé dideoxynukleotidy jsou v porovnání s jednotlivými nukleotidy v reakci zastoupeny jen v relativně malém množství,

reakce je prováděná ve čtyřech zkumavkách, kdy každá ze zkumavek obsahuje „svůj“ dideoxynukleotid (ddNTP),

dideoxynukleotidy se náhodně začlení do syntetizovaného řetězce místo příslušného dNTP (např. místo dATP dosedne ddATP). A protože ddNTP nemají OH skupinu, po jejich dodání do syntetizovaného řetězce se syntéza zastaví. Vzhledem k tomu, že v každé reakci je obrovské množství molekul DNA a že začleňování ddNTP se děje náhodně, a to díky jejich nízké koncentraci jen s nízkou pravděpodobností (část molekul je v příslušném místě obsazena dNTP a část ddNTP), vzniká v každé reakci směs různě dlouhých fragmentů. Délka každého z fragmentů udává pozici příslušného ddNTP,

délka fragmentů je analyzovaná pomocí elektroforézy v polyakrylamidovém gelu, a to tak, že se na gel nanesou vedle sebe produkty ze všech čtyř zkumavek a po separaci fragmentů se díky radioaktivnímu značení primerů odečte délka jednotlivých fragmentů. Pozice jednotlivých fragmentů odpovídají pozicím jednotlivých nukleotidů v sekvenovaném vzorku.

V modifikované podobě Sangerova metoda využívá fluorescenčně značených dideoxynukleotidů (každý ddNTP nese svou barevnou značku), což umožňuje provedení reakce v jedné zkumavce. Produkty jsou pak analyzovány kapilární elektroforézou a je získán výsledný sekvenogram.

Sangerova metoda

Praktické využití Sangerovy metody

V kapilárovém provedení je Sangerova metoda v současné době stále nejpoužívanější a nejspolehlivější metodou sekvenování. V drtivé většině případů jsou vzorky sekvenovány komerčně specializovanými pracovišti, kdy je pracovišti dodána templátová DNA a případně primery. Při kapilárním sekvenování jsou sekvenovány jednotlivé fragmenty DNA, připravené PCR amplifikací či klonováním, s tím, že při jednom běhu sekvenátoru je obvykle možnost paralelní sekvenace maximálně 96 sekvencí (96 kapilárové sekvenátory). Délka získaných sekvencí je cca 700 bp a tedy maximální sekvenační výtěžek z jednoho běhu sekvenátoru je cca 67 kb. Chybovost Sangerovy metody sekvenování se pohybuje kolem 1,5 % (tzn., jedna báze z cca 66 bází je přečtena chybně).

Literatura:

Maxam AM, Gilbert W (1977). A new method for sequencing DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74 (2): 560–4.

Sanger F, Coulson AR (1975). A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J. Mol. Biol. 94 (3): 441–8.

Smith LM, Sanders JZ, Kaiser RJ et al. (1986). Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature 321 (6071): 674–9.