Gibsonovo klonování

GIBSONOVO KLONOVÁNÍ

Jedná se o účinnou a jednoduchou metodu klonování, při kterém v rámci jedné isotermální reakce (za použití tří různých enzymů, ale konstantní teploty) můžeme najednou pospojovat několik dvouřetězcových fragmentů DNA v jeden úsek.

Metoda je založena na PCR přípravě fragmentů se vzájemně překrývajícími se konci. Délka překrytí by měla být cca 30 bp.

Při následné reakci jsou tyto konce štěpeny T5 Exonukleázou, která na těchto koncích vytváří 3’ jednořetězcové převisy. Vzhledem k identické sekvenci, které konce dvou daných fragmentů mají, po štěpení T5 Exonukleázou vznikají na koncích fragmentů komplementární úseky, které umožní svou vzájemnou hybridizaci a tedy spojení dvou fragmentů v jeden celek za účasti T4 DNA ligázy, která fragmenty spojí a Phusion polymerázy, která doplní vzniklé mezery.

Postup při Gibsonově klonování 

1. krok – PCR: Ke koncům klonovaných úseků jsou navrženy primery, které docílí překrytí konců dvou fragmentů, které chceme spojit. Délka primeru by měla být cca 60 bp, přičemž prvních cca 30 bazí od 5’ konce pokrývá sekvenci druhého fragmentu. Reakcí získáme fragmenty, které mají vzájemně se překrývající se konce.

2. krok – příprava roztoků

 

Příprava 5X ISO pufru

3 ml  1 M Tris-HCl pH 7.5

150 μl of 2 M MgCl2

60 μl 100 mM dGTP

60 μl  100 mM dATP

60 μl  100 mM dTTP

60 μl  100 mM dCTP

300 μl  1 M DTT

1.5 g PEG-8000

300 μl  100 mM NAD

doplňte vodou do 6 ml, důkladně promíchejte, alikvotujte po 100 μl a skladujte při -20 °C.

 

Příprava reakční směsi:

320 μl 5X ISO buffer

0.64 μl 10 U/μl T5 exonukleáza

20 μl 2 U/μl Phusion polymeráza

160 μl 40 U/μl Taq ligáza

dodejte vodu do 1.2 ml, alikvotujte po 15 μl a skladujte při -20 °C.

Tato reakční směs může být skladována při -20 °C nejméně jeden rok. Enzymy zůstávají aktivní nejméně po 10 rozmražovacích/zamražovacích cyklech.

3. krok – samotná isotermální reakce

Na reakci požijeme 5 μl směsi klonovaných fragmentů, které jsou zastoupeny v  ekvimolárním množství. Celkové množství DNA by mělo být 20-20 ng. K DNA přidáme 15 μl reakční směsi.

Směs inkubujeme při 50oC 15- 60 min.

Provedeme transformaci do baktérií.

Gibson assembly

 

Gibson assembly obr