Dot Blot hybridizace

Hybridizační techniky

sipka vlevo

——————————————————————————————————————————–

DOT/BLOT HYBRIDIZACE

Při Dot Slot/Blot hybridizaci se DNA obvykle nakape pipetou na membránu, kde se imobilizuje UV či teplem a standardně se provádí hybridizace a detekce.

dot blot

 

Imobilizace vzorků na membráně

Vzorky DNA jsou nejprve pro získání jednovláknových molekul denaturovány, a to zahřátím na 100 °C, po dobu 5 min a následně rychlým zchlazením přeneseny na led, kde jsou vzorky inkubovány alespoň 3 min.

Denaturovaná DNA je pipetou v kapkách o 1-2 μl nanesena na membránu. Vzorky na membráně fixujeme pomocí UV buď přímo v UV crosslinkeru nebo 3 min na transiluminátoru, alternativně 30-60 min při 120°C.

S membránou manipulujeme zásadně v rukavicích. Nejlépe membránu držíme za její okraje pinzetou.

Hybridizace

Suchou nylonovou membránu navlhčíme ponořením do vody. Přeneseme membránu do 0,1X SSC/0,5% SDS. Inkubujeme při 65°C, 1 hod.

 

Membránu vložíme do prehybridizačního roztoku předehřátého na 65°C. Na každý 1cm2 membrány použijeme alespoň 100 ul prehybridizačního roztoku. Inkubujeme za stálého promíchávání při 65 °C, 2 hodiny.

 

Tip Prehybridizace a hybridizace mohou být prováděny v hybridizačních válcích nebo vhodných plastových nádobách nebo také igelitových pytlících, jejichž okraje jsou utěsněny zavařením nebo zalepením (využití igelitových pytlíků je výhodné, pokud prehybridizujeme/hybridizujeme v malých objemech roztoků).

 

Prehybridizační roztok *

hybrid roztok

* skladováno v alikvotech v -20°C, před použitím přidejte denaturovanou DNA lososích spermií a temperujte na 65°C.

** do roztoku se přidává až před použitím. Před přidáním se DNA lososích spermií denaturuje zahřátím na 95°C, 5 min a poté prudkým zchlazením uložením na led na min. 1 min.

 

  Prehybridizační roztok vyměníme za hybridizační roztok, který jsme předem vytemperovali na 65 °C a přidali jsme denaturovanou sondu. Denaturace sondy se provádí zahřátím sondy na 95°C  po dobu 5 min. a následně jejím rychlým zchlazením, a to přenesením zkumavky na led na 3 min.Množství přidávané sondy se odvíjí od způsobu značení. Pokud je sonda značená 32P, obvykle přidáváme tolik sondy, aby výsledná koncentrace byla 2 x 106 cpm/ml (může být v rozmzí od 0,5 x 106 až 3 x 106 cpm/ml). Pokud je sonda značena neradioaktivně, řídíme se doporučením výrobce značícího systému.

 

Hybridizační roztok*

tabulka hybr

 * skladováno v alikvotech v -20°C, před použitím přidejte denaturovanou DNA lososích spermií a temperujte na 65°C.

** do roztoku se přidává až před použitím. Před přidáním se DNA lososích spermií denaturuje zahřátím na 95°C, 5 min a poté prudkým zchlazením uložením na led na min. 1 min.

Hybridizaci provádějte 12-16 hod při teplotě:

u většiny dlouhých sond (>100 bazí) 65-68 oC

u krátkých/oligo sond (< 50 b) je hybridizační teplota o 5 oC nižší než je teplota Tm. Teplota Tm = 4x počet GC párů + 2x počet AT párů

 

Posthybridizační promývání

Membrána je promývána nízko-stringentními podmínkami, pokud očekáváme, že sonda není úplně identická s cílovou sekvencí. V opačném případě používáme vysoce-stringentní podmínky.

 

Při vysoce-stringentních podmínkách:

Promyjeme membránu v promývacím roztoku I (2X SSC/0,1% SDS), při pokojové teplotě 5 min, za konstantního promíchávání.

 

Promývací roztok I nahradíme promývacím roztokem II (0,1x SSC/0,1% SDS). Promýváme při 65°C, 10 min. Tento promývací krok 1-2x opakujeme.

 

Při nízko-stringentních podmínkách:

Pro promývání s nízko-stringentními podmínkami se využívá pouze 2x SSC/0,1% SDS, teplota je určena empiricky, kdy jako nejnižší je použita 37°C.

 

  

Detekce sondy: Proveďte detekci sondy buď autoradiograficky v případě radioaktivně značené sondy nebo jiným systémem dle způsobu značení sondy.

 

Odstranění sondy navázané na membráně pro opětovné použití membrány

Nylonové membrány mohou být použity 10-30x. Suchá membrána může být uskladněna při pokojové teplotě.

Vložte membránu do roztoku 0,2N NaOH a za konstantního promíchávání inkubujte 10 min. Použijte cca 1-2 ml NaOH na každý 1cm2. Odstraňte NaOH.

Promyjte membránu 3x v 0,1 SSC/0,1% SDS/50 mM Tris-HCl (pH 7,5), po 5 min. Použijte cca 1-2 ml roztoku na každý 1cm2. Monitorujte pH promývacího roztoku po mocí pH papírku. Pokud roztok není neutrální, opakujte promývací kroky.

 

 

Alternativní prehybridizační a hybridizační roztoky

Alternativně mohou být pro prehybridizaci a hybridizaci použity roztoky s přídavkem formamidu, který snižuje teplotu tání DNA. Tímto může být hybridizace prováděna při 42°C.

 

Prehybridizační roztok s formamidem*

prehyb roztok s formamidem

* skladováno ve  4°C, délka skladovatelnosti 4 max. 4 měsíce, před použitím přidejte denaturovanou DNA lososích spermií a temperujte na 65°C.

** do roztoku se přidává až před použitím. Před přidáním se DNA lososích spermií denaturuje zahřátím na 95°C, 5 min a poté prudkým zchlazením uložením na led na min. 1 min.

 

 

Hybridizační roztok s formamidem*:

hybrid roztok s formamidem copy

* skladováno ve  4°C, délka skladovatelnosti 4 max. 4 měsíce, před použitím přidejte denaturovanou DNA lososích spermií a temperujte na 65°C.

** do roztoku se přidává až před použitím. Před přidáním se DNA lososích spermií denaturuje zahřátím na 95°C, 5 min a poté prudkým zchlazením uložením na led na min. 1 min.

 

Příprava 1M fosfátu sodného (pH 6,7)

Rozpustíme 14,196 g Na2HPO4 v 80 ml vody. Upravíme pH na 6,7 pomocí kyseliny fosforečné a doplníme do 100 ml.