454 (Roche)

 

Technologie 454, která byla vyvinuta firmou Roche, využívá metodu pyrosekvenování, a to fragmentů, které jsou připraveny pomocí emulzní PCR. Obecné schéma metody je:

V prvním kroku je DNA fragmentovaná na úseky o velikosti 300-800 bp.

Na konce vzniklých fragmentů jsou upevněny dva typy adaptérů, s cílem toho, aby každý fragment nesl na jednom konci jeden adaptér a na druhém konci druhý adaptér. Fragmenty, které nenesou oba adaptéry, jsou odstraněny.

Pomocí sekvence adaptéru jsou fragmenty imobilizovány na speciálních kuličkách, a to tak, že každá kulička nese jeden fragment. Každá jednotlivá kulička je enkapsulovaná (zapouzdřená) do emulze v/o (voda v oleji) pomocí přídavku emulzního oleje.Zapouzdření jednotlivých kuliček emulzí umožní následnou emulzní PCR.

Každá kulička má k dispozici všechny potřebné komponenty pro PCR reakci. PCR reakce v zapouzdřených kuličkách umožňuje klonální amplifikaci DNA, tj. amplifikaci jednotlivých molekul DNA.

Po proběhnutí PCR jsou kuličky vyňaty z emulze a jednotlivě umístěny do jamek pikotitrační destičky, a to spolu s DNA polymerázou, ATP sulfurylázou a luciferázou. Pomocí DNA polymerázy dochází na všech templátových molekulách, které jsou navázané na kuličku, k syntéze DNA. A to tak, že na destičku je postupně aplikován roztok, který obsahuje  jen jeden typ nukleotidu. Roztoky s jednotlivými nukleotidy jsou postupně obměňovány.

Pokud se nukleotid po přidání daného roztoku začlení do vznikajícího řetězce (protože je komplementární k danému templátu), dochází díky série enzymatických reakcí k produkci luminiscence. Předně dochází k  produkci ATP pomocí ATP sulfurylázy, a to za přítomnosti adenosin 5‘ fosfosulfátu. Vzniklé ATP slouží pro konverzi luciferinu na oxyluciferin, což vede k produkci světla. Vzniklé světlo je zachyceno detektorem. Poslední reakcí je odstranění ATP a neinkorporovaných dNTP pomocí apyrázy.

Proces je následně opakován s dalšími nukleotidy. Paralelně jsou tak analyzovány až statisíce kuliček.

 

VYUŽITÍ. Pyrosekvenování je vhodné především pro mutační analýzu (analýzu SNPs), kvantifikaci alel, tzn. při diagnostice chorob, stanovování klinické prognózy nebo také genotypizaci baktérií.

 pyrosekvenování

pyrosekvenovani obr

Literatura:

Ansorge WJ (2009). Next-generation DNA sequencing techniques. N. Biotechnol. 25:195-203.

King, C; Scott-Horton, T. (2008). „Pyrosequencing: a simple method for accurate genotyping“. J Vis Exp (11).

Metzker J: (2010) Sequencing technologies – the next generation. Nat.Rev.Genet. 11: 31-46.

Pemov AH et al. (2005). DNA analysis with multiplex microarray-enhanced PCR. Nucleic Acids Res. 33:e11.

Williams R. et al. (2006). Amplification of complex gene libraries by emulsion PCR. Nature Methods 3, 545 – 550.

www.454.com